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Mar 16, 2023

Medición de la expresión de antígenos de líneas celulares cancerosas y células tumorales circulantes

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6051 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Al evaluar las tecnologías de enriquecimiento basadas en EpCAM para células tumorales circulantes (CTC), las líneas celulares utilizadas deben parecerse mucho a las CTC reales, lo que significa que se debe conocer la expresión EpCAM de las CTC, pero también se debe conocer la expresión EpCAM de las líneas celulares en diferentes instituciones y momentos. importante. Como la cantidad de CTC en la sangre es baja, enriquecimos las CTC mediante el agotamiento de los leucocitos de los productos de leucoaféresis de diagnóstico de 13 pacientes con cáncer de próstata y medimos la expresión de EpCAM mediante citometría de flujo cuantitativa. La expresión del antígeno se comparó entre múltiples instituciones midiendo los cultivos de cada institución. También se midió la eficiencia de captura para una de las líneas celulares utilizadas. Los resultados muestran que las CTC derivadas de pacientes con cáncer de próstata sensibles a la castración tienen una expresión de EpCAM variable pero relativamente baja, con una mediana de expresión por paciente que oscila entre 35 y 89 534 (media de 24 993) moléculas por célula. Se encontró una gran variación en la expresión de antígenos de líneas celulares idénticas cultivadas en diferentes instituciones, lo que resultó en recuperaciones al usar el sistema CellSearch que van del 12 al 83 % para la misma línea celular. Concluimos que pueden ocurrir grandes diferencias en la eficiencia de captura al usar la misma línea celular. Para parecerse mucho a las CTC reales de pacientes con cáncer de próstata sensibles a la castración, se debe usar una línea celular con una expresión de EpCAM relativamente baja, y su expresión se debe controlar con frecuencia.

Las líneas celulares a menudo se utilizan para comparar diferentes métodos u optimizar protocolos para el enriquecimiento y aislamiento de células tumorales circulantes (CTC). Las líneas celulares utilizadas se recogen en algunos artículos o revisiones donde se comparan varias tecnologías de enriquecimiento1,2,3,4. Esto hace que la comparación sea aparentemente más justa, ya que características como el tamaño, la deformabilidad y la expresión de antígenos pueden diferir ampliamente entre diferentes líneas celulares. Especialmente la última característica es de gran importancia cuando se evalúan tecnologías de enriquecimiento basadas en antígenos.

Cuando se usa un antígeno de superficie para la captura selectiva de células raras, es necesario generar una gran cantidad de interacciones entre las superficies recubiertas y las células, al mismo tiempo que se permite la retención de las células capturadas. El método más utilizado para esto es la captura inmunomagnética, en la que las perlas (superpara)magnéticas se recubren con un anticuerpo5. Para la captura de CTC, en la mayoría de los casos, el antígeno de relevancia es la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), un antígeno que se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres de origen epitelial tanto en el tejido tumoral como en las CTC6. Un ejemplo de enriquecimiento inmunomagnético es el sistema CellSearch, que es el método más utilizado para el enriquecimiento de CTC7.

La eficacia de dicho enriquecimiento depende en gran medida del número de antígenos presentes en la superficie celular. Por lo tanto, se deben usar líneas celulares con características de expresión comparables al evaluar estas tecnologías, imitando así más fielmente las CTC reales. Aquí no solo se deben considerar las características utilizadas para la captura, sino también las utilizadas para la identificación de los CTC. Por ejemplo, se ha demostrado que el nivel de expresión de citoqueratina (CK) de la línea celular LNCaP de uso frecuente es mucho más alto que el de las CTC8 del paciente, lo que hace que su identificación sea increíblemente fácil.

El uso de una línea celular con una expresión realista de EpCAM es aún más relevante dado el conocimiento más reciente de la existencia de una subpoblación de CTC con EpCAM bajo o incluso EpCAM negativo9,10,11,12,13. Varios estudios ya han intentado aumentar la sensibilidad de sus métodos de captura basados ​​en antígenos, ya sea mediante el uso de antígenos adicionales14,15 o aumentando la fuerza magnética generada16,17,18, mientras que muchos también se han centrado en métodos de captura completamente independientes de EpCAM19. Todos estos métodos están diseñados para capturar también células con baja expresión de EpCAM; incluso el sistema CellSearch utiliza un enfoque patentado especializado para unir suficientes partículas magnéticas a CTC con baja expresión de EpCAM20.

Dado que cualquier aumento de la sensibilidad generalmente se hará a costa de la especificidad, sería beneficioso conocer la sensibilidad necesaria de dicho sistema. Para ello, es necesario conocer el nivel de expresión de antígenos de las CTC en muestras de pacientes. Aunque hay varios estudios en los que se evalúa la expresión de EpCAM en CTC21,22,23, según nuestro conocimiento, solo Rao et al. han intentado medir cuantitativamente la expresión EpCAM de CTCs24, mostrando grandes diferencias entre la expresión EpCAM medida y varias líneas celulares de uso común. En este trabajo, sin embargo, establecieron un umbral mínimo de expresión de EpCAM para la identificación de CTC, excluyendo así cualquier CTC bajo o negativo de EpCAM. Esto significa que se necesita la cuantificación de la expresión de EpCAM en la población total de CTC para poder seleccionar de manera efectiva las líneas celulares más representativas, lo que permite una determinación realista de la sensibilidad de cualquier ensayo de captura basado en EpCAM.

Para este propósito, no solo será necesario conocer la expresión de EpCAM en CTC, sino también la de varias líneas celulares. Como se sabe que las características celulares in vitro cambian con el tiempo25, no solo es importante el nivel actual de expresión del antígeno, sino también la variación. Es probable que esta variación se minimice si se cumplen ampliamente las condiciones de cultivo recomendadas por la ATCC. En la práctica, sin embargo, a menudo se aplican condiciones de cultura dependientes de la institución, lo que puede conducir a grandes diferencias entre instituciones. Para probar esto, medimos la expresión de varios antígenos relacionados con el cáncer en diferentes líneas celulares cuando se cultivaron usando nuestras propias condiciones de cultivo estándar, así como en células que se cultivaron en diferentes instituciones usando sus condiciones de cultivo estándar.

Como las CTC son muy raras en cánceres especialmente no metastásicos, pero también metastásicos tempranos26, la medición de sus características es un desafío. Una forma de lograr un mayor número de CTC es mediante el uso de la leucoféresis27, que permite interrogar mayores volúmenes de sangre. Por lo tanto, con el objetivo de medir cuantitativamente su nivel de expresión de EpCAM, hemos identificado CTC de cáncer de próstata en muestras de pacientes derivadas de leucoaféresis utilizando marcadores que no son de EpCAM. Además, hemos comparado su expresión de EpCAM con la de varias líneas celulares de cáncer de uso frecuente.

Para cuantificar la expresión de diferentes antígenos, las células se tiñeron usando anticuerpos monoclonales acoplados a ficoeritrina (PE), después de lo cual se determinó el número de moléculas de PE por célula usando citometría de flujo cuantitativa. Aunque el número de moléculas de PE no será exactamente igual al número de antígenos, en este trabajo trataremos el número de moléculas de PE por célula como representativo del número de antígenos expresados.

La expresión del antígeno se puede medir directamente, utilizando un anticuerpo con un fluoróforo conjugado, o mediante un anticuerpo no conjugado que luego se marca con un anticuerpo secundario que se conjuga con un fluoróforo. La Figura 1A muestra que la expresión medida en las cinco líneas celulares utilizadas es menor cuando el antígeno EpCAM se marca con un anticuerpo conjugado directamente en comparación con el uso de una tinción de anticuerpo secundario (Prueba de rangos con signos de Wilcoxon, p < 0,0001). Esto es de esperar, ya que cuando se usa un anticuerpo secundario policlonal (p. ej., anti-PE de ratón), más de un anticuerpo puede unirse al anticuerpo primario, lo que da como resultado una señal de PE más alta. Este fenómeno coincide con la diferencia en la expresión cuantificada, que difiere hasta un factor de tres (media 2,1, rango 0,7-3,6). Como esta variación se observa en todas las líneas celulares, las diferencias de expresión relativas entre las líneas celulares siguen siendo similares.

(A) Expresión de EpCAM de PC3 no fijado (N = 11), MCF7 (N = 4), SKBR3 (N = 4) y LNCaP (N = 11) medida con un anticuerpo conjugado directamente o mediante tinción de anticuerpo secundario. (B) Expresión de EpCAM y Her2 de células LNCaP medida usando células fijadas con formaldehído al 1% o sin fijar (N = 3). (C) Expresión de CK, Her2 y EpCAM medida en células LNCaP y PC3 no fijadas, fijadas con CellSave y fijadas con formaldehído al 1 % después de 24 h (N = 1).

El tiempo entre la recogida de la muestra y la cuantificación del antígeno en la muestra de un paciente es en nuestro caso de aproximadamente 24 h, por lo que la expresión del antígeno debe conservarse durante este periodo. En muchos casos, esto se logra a través de la fijación28, ya sea usando un fijador suave como CellSave (Menarini-Silicon Biosystems) o Cytochex (Streck), o un fijador más duro como Transfix (Caltag Medsystems) o formaldehído al 1–4% (Merck) . El efecto que tiene una fijación intensa sobre la expresión medida de EpCAM y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Her2) se determinó en cuatro experimentos independientes. En la Fig. 1B se puede ver que se encuentra una reducción significativa (Prueba de rangos con signo de Wilcoxon, p = 0,002) en la expresión del antígeno medido tras la fijación celular, con una disminución promedio del 72 % (rango 52–93 %). También probamos la expresión de CK, Her2 y EpCAM después de 24 h usando células no fijadas almacenadas a 4 °C, células fijadas con CellSave y células fijadas con formaldehído al 1%. Los resultados en la Fig. 1C muestran una mayor expresión preservada de EpCAM y Her2 usando CellSave en comparación con las células no fijadas, mientras que la fijación de formaldehído resultó en una gran disminución de la citoqueratina intracelular, probablemente causada por el agente de permeabilización que no pudo permeabilizar suficientemente las células. membrana reticulada para permitir el paso del fluoróforo PE relativamente grande.

Determinamos la expresión de EpCAM y Her2 cada dos meses en células de las líneas celulares PC3, PC3-9 y LNCaP durante un período de 20 meses (11 mediciones), y células de las líneas celulares MCF7 y SKBR3 durante un período de 6 meses. (cuatro mediciones), Fig. 2. Aquí, se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p < 0.02) en la expresión de Her2 entre todas las combinaciones de líneas celulares excepto cuando se comparó PC3 con LNCaP (p = 0.17), PC3 con PC3-9 (p = 1) o LNCaP con MCF7 (p = 1). La expresión de EpCAM mostró una diferencia significativa entre PC3 y PC3-9 en comparación con todas las demás líneas celulares (p < 0,01). No se encontraron diferencias significativas entre la expresión de EpCAM de PC3 y PC3-9 (p = 0,07), LNCaP y SKBR3 (p = 0,20), MCF7 y LNCaP (p = 1) o MCF7 y SKBR3 (p = 0,14), lo que indica que para estas líneas celulares, la variación en la expresión medida dentro de la misma línea celular es demasiado grande en este conjunto de datos para distinguir significativamente la diferencia en la expresión entre estas líneas celulares.

Expresión de (A) Her2 y (B) EpCAM en PC3, PC3-9, MCF7, SKBR3, LNCaP no fijados, así como en LNCaP fijado con formaldehído medido durante un período de 6 o 20 meses. Los recuadros indican el percentil 25-75 con la mediana como una línea horizontal, los bigotes indican el percentil 10-90.

Para evaluar si la variación observada dentro de cada línea celular fue causada por cambios en la expresión del antígeno o por variación experimental, también medimos la expresión de Her2 y EpCAM en una muestra fija de células LNCaP durante el mismo período de 6 meses, ver Fig. 2. La mediana de la expresión de Her2 de las células LNCaP no fijadas fue de 46 523 moléculas por célula, pero se redujo en un 80 % a 9133 antígenos en la muestra fijada (p < 0,01), lo que puede atribuirse al efecto de la fijación, como se ve en la Fig. 1B. Sin embargo, el coeficiente de variación (CV) de la expresión de Her2 para la muestra fija fue solo ligeramente superior al de la muestra no fija (37 % frente a 27 %). De manera similar, la expresión mediana de EpCAM de células LNCaP no fijadas fue de 728 738 antígenos por célula y disminuyó en un 71 % a 213 430 antígenos por célula para las células LNCaP fijadas (p < 0,01). Sin embargo, el CV de la expresión de EpCAM en la muestra fijada (51 %) fue similar al CV de la muestra no fijada (54 %). El CV de la expresión de Her2 de todas las líneas celulares osciló entre 13 y 52 % y para EpCAM entre 30 y 75 %.

Teniendo en cuenta la variación similar observada en las muestras fijadas en comparación con las muestras no fijadas, la causa principal de la variación medida en la expresión de Her2 y EpCAM puede atribuirse a variaciones en la medición y no a cambios en la línea celular real. En la figura complementaria S1, se muestran los mismos puntos de datos en el tiempo, donde también se puede ver un patrón similar de cambios de expresión para múltiples líneas celulares, lo que está en línea con los cambios que son principalmente el resultado de la variación interexperimental. Sin embargo, también queda claro a partir de estos datos que las diferencias en la expresión entre estas líneas celulares son mucho mayores que la variabilidad de medición que encontramos, lo que indica que, aunque no se pueden obtener cuantificaciones exactas, esta medición se puede usar para determinar el rango de expresión del antígeno.

A partir de la Fig. 2 queda claro que existe una variación relativamente grande en la expresión medida entre diferentes experimentos realizados a intervalos de aproximadamente dos meses. Para determinar en qué medida afectó esto a la comparación de expresiones en un solo experimento, determinamos la variación intraexperimental midiendo la expresión de EpCAM y Her2 en células PC3-9 y LNCaP usando muestras por triplicado dentro del mismo experimento, y el corto variación interexperimental a término utilizando tres repeticiones dentro de la misma semana. Para ello, utilizamos un lote de células fijas para evitar variaciones en las condiciones de cultivo. Los resultados se muestran en la figura complementaria S2 y muestran que para experimentos por triplicado realizados el mismo día, la variación intraexperimental del antígeno EpCAM altamente expresado en células LNCaP es relativamente baja con un CV del 5,6 %, pero aumenta para antígenos con menor expresión hasta un 144% para la expresión de Her2 en PC3-9. De manera similar, la variación interexperimental es del 20 % para el antígeno EpCAM en células LNCaP y aumenta al 94 % para los antígenos Her2 en células PC3-9. Esto confirma que es posible determinar el rango de expresión de antígeno de células con baja expresión de antígeno, así como cambios múltiples en líneas celulares de expresión media a alta. Sin embargo, la cuantificación de expresiones antigénicas especialmente bajas debe verse como una confirmación del rango de expresión antigénica, no como una determinación cierta del nivel exacto de expresión antigénica de las células.

Muchas instituciones utilizan las mismas líneas celulares, lo que aparentemente permite la comparación directa de, por ejemplo, tecnologías de enriquecimiento inmunomagnético. Sin embargo, las instituciones a menudo tienen líneas celulares en cultivo durante un tiempo prolongado y, con el tiempo, la expresión del antígeno de estas células puede variar, ya sea como resultado de diferentes condiciones de cultivo o simplemente debido al muestreo estocástico en el paso. Para medir las diferencias que existen en la expresión de varios antígenos relacionados con tumores, comparamos sus niveles de expresión en cuatro líneas celulares de al menos tres instituciones, así como un vial adquirido directamente de la American Type Culture Collection (ATCC). Para ello, se congeló una alícuota de las líneas celulares en nitrógeno líquido en cada sitio y se envió a la Universidad de Twente. La Tabla complementaria S1 muestra los detalles de cultivo para cada institución y el número de pases de las células en el momento de la medición. En la mayoría de los casos, las instituciones utilizan sus propios métodos de cultivo que pueden desviarse de las recomendaciones de la ATCC. En la Universidad de Twente, todos los cultivos de una de las líneas celulares se descongelaron y se dejaron crecer durante aproximadamente 1 semana. Luego, en un solo experimento, se determinaron las expresiones de antígeno de todos los cultivos de esa línea celular. De esta forma, para cada línea celular, se midieron las expresiones antigénicas de todos los cultivos disponibles en un único experimento.

La figura 3 muestra los histogramas de la señal PE medida mediante citometría de flujo. En la Fig. S3 complementaria, se representa el número medio correspondiente de antígenos para cada antígeno y línea celular. Se pueden observar varias diferencias en la expresión de estos antígenos entre los cultivos mantenidos en diferentes instituciones, como la expresión reducida de PSMA en la línea celular LNCaP en la Universidad de Twente o la gran variación en la expresión de CK en todas las líneas celulares. En la expresión de CK de SKBR3 y la expresión de EpCAM de las líneas celulares PC3 parece que en estas líneas celulares, el cultivo en la ATCC del que se originan todos los demás, ya contiene dos subpoblaciones. Aunque Erasmus y la Universidad de Twente usan las mismas condiciones de cultivo para PC3 y tienen números de pases similares, la subpoblación que expresa EpCAM alta parece haber proliferado en Erasmus, mientras que la subpoblación de expresión baja se ha vuelto dominante en la Universidad de Twente.

La expresión de EpCAM, Her2, PSMA y citoqueratina (CK) en LNCaP, MCF7, PC3 y SKBR3 de ATCC, Erasmus MC (EMC), London Institute for Cancer Research (ICR), Universitätsklinikum Düsseldorf (UKD) y University of Twente ( UTAH). Los histogramas de la señal de PE se muestran medidos mediante citometría de flujo.

Dado que EpCAM es el antígeno que se usa principalmente para capturar CTC, se espera que una variación en la expresión de este antígeno genere una diferencia en la eficiencia de captura percibida de las tecnologías de enriquecimiento de CTC. Para probar esto, agregamos números exactos de células PC3 de cada una de las cuatro instituciones en muestras de sangre de donantes sanos. Luego procesamos estas muestras usando el sistema CellSearch y determinamos la recuperación de células PC3 para cada institución.

En la Fig. 4 se muestra la expresión de EpCAM medida así como la recuperación de CellSearch de células PC3 de cada uno de los cuatro orígenes. La recuperación va desde el 12 % para células PC3 cultivadas en la Universidad de Twente hasta el 83 % para células PC3 cultivadas en Erasmus MC. La regresión lineal después de la transformación logarítmica de la expresión de EpCAM dio como resultado una regresión de CSrec = − 101 + 30∙log (EpCAMexpr) con un R2 de 0,97. Para confirmar que las células son realmente células PC3, se realizó un análisis de repetición en tándem corto (STR) en PC3 (UT) y PC3 (EMC), lo que confirma que estas líneas celulares son todas células PC3 (ATCC). Este análisis también confirmó que las células PC3-9 utilizadas son un subclon de la línea celular PC3, como lo indica su perfil STR.

EpCAM expresión de PC3 de ATCC, Erasmus MC (EMC), London Institute for Cancer Research (ICR) y University of Twente (UT) junto con la recuperación de CellSearch de cada una de las líneas celulares. N = 3. La barra de error indica la media ± DE.

Evaluamos la expresión EpCAM de CTC de 13 pacientes con cáncer de próstata metastásico sometidos a leucoaféresis diagnóstica (DLA). Los CTC se enriquecieron a partir de muestras derivadas de DLA mediante el agotamiento inmunomagnético de los leucocitos con una eficiencia que osciló entre el 77,2 y el 97,1 % (media del 90,3 %, SD del 7,4 %). En la Tabla complementaria S2 se muestra una descripción general de la muestra de entrada y la eficiencia de agotamiento de todos los pacientes. Después del agotamiento, las muestras se tiñeron con CD45-, CD16-, biotina-FITC, Hoechst, citoqueratina-APC, PSMA-PerCP/Cy5.5 y EpCAM-PE. Después de lavar, las muestras se resuspendieron en 1 ml de PBS/BSA al 1 % y se procesaron en un FACS Aria II (BD Biosciences) usando un umbral en Hoechst para incluir solo eventos nucleados. En la figura complementaria S4 se muestra un ejemplo de la medición de citometría de flujo. Los eventos se consideraron CTC cuando fueron negativos para CD45/CD16/biotina y positivos para Hoechst, citoqueratina y PSMA. Aunque la adición de la positividad de PSMA en los criterios para la identificación de CTC aumenta la certeza de su correcta identificación, este enfoque pasará por alto algunas CTC, ya que no todas las CTC son positivas para PSMA. A continuación, se cuantificó la expresión de EpCAM en las CTC identificadas. Para ver si las intensidades medidas se podían comparar directamente con las medidas de la línea celular, se midió la expresión de antígenos de las células PC3 y LNCaP después de introducir las células en el material DLA y se comparó con la de las mismas células medidas directamente. Los resultados que se muestran en la figura complementaria S5 indican que, aunque existe una diferencia en el número medido de antígenos por célula, esta diferencia es mucho menor que las diferencias observadas entre líneas celulares, así como entre líneas celulares y CTC de pacientes.

La Figura 5A muestra los niveles de expresión de EpCAM medidos de las CTC individuales encontradas en 13 pacientes con cáncer de próstata. Por paciente se midió una mediana de 15 CTC (media 148 CTC, rango 2-1457 CTC). Como la expresión de EpCAM en las CTC del paciente 12 se extiende más allá de la escala de la figura 5A, también se muestra por separado en una escala logarítmica en la figura 5B. Las expresiones EpCAM medidas muestran una gran variación, tanto dentro como entre pacientes, con una mediana por paciente que oscila entre 35 y 89 534 (media 24 993, SD 28 521). En la Tabla complementaria S2 se muestra la media, la mediana y el CV de la expresión EpCAM medida de todos los pacientes. Aquí también se muestra la recuperación relativa de CTC en comparación con la cantidad de CTC positivos para PSMA que se encontraron usando el sistema CellSearch.

Expresión EpCAM de CTC encontrada en productos de leucoaféresis de 13 pacientes con cáncer de próstata sensibles a la castración. (A) Expresión de CTC recuperadas de pacientes P1-P13 en una escala lineal que muestra una gran variación tanto entre pacientes como dentro de un paciente. (B) Expresión de CTC recuperadas del paciente P12 en una escala logarítmica. Los recuadros indican la mediana ± SD. Debido a la compensación aplicada para la autofluorescencia, algunas células han alcanzado una expresión medida negativa.

Para ver cómo la expresión de EpCAM de las CTC de los pacientes se relaciona con la de las líneas celulares de cáncer de uso frecuente, combinamos la expresión de EpCAM medida de todas las CTC de los pacientes y la comparamos con la expresión de EpCAM de las cinco líneas de células cancerosas diferentes, medida en un período de 6 a 20 período de un mes, como se muestra en la Fig. 6. Aquí, cada círculo indica la expresión de EpCAM medida en un paciente separado, mientras que el tamaño del círculo está relacionado con el número de CTC medidas. Los valores de p mostrados se determinaron utilizando la prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov. Puede verse que las líneas celulares PC3 y PC3-9 cultivadas en la Universidad de Twente muestran una expresión similar a las CTC de pacientes, mientras que las otras tres líneas celulares muestran expresiones de EpCAM mucho más altas, lo que las hace inadecuadas como sustituto de CTC en la evaluación. de métodos de enriquecimiento o identificación basados ​​en EpCAM.

Expresión de EpCAM de CTC de 13 pacientes con cáncer de próstata en comparación con la expresión medida en cinco líneas celulares cultivadas en la Universidad de Twente. La posición del círculo indica la expresión mediana por paciente y el tamaño del círculo se relaciona con la cantidad de CTC medidas de cada paciente. Los recuadros indican el percentil 25-75 con la mediana como una línea horizontal, los bigotes indican el percentil 10-90. * indica una diferencia significativa, valores de p determinados mediante la prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov.

Las líneas celulares de carcinoma de próstata PC3 y LNCaP y las líneas celulares de carcinoma de mama MCF7 y SKBR3 se obtuvieron de ATCC (Manassa, VA, EE. UU.). La línea celular PC3-924, un subclon de la línea celular PC3, fue proporcionada amablemente por Immunicon (Huntingdon Valley, PA, EE. UU.). PC3, PC3-9 y LNCaP se cultivaron en RPMI1640 (Lonza), MCF7 y SKBR3 en DMEM (Lonza), todos complementados con FBS al 10 % (Sigma) y Pen/Strep al 1 % (Lonza). Las células se cultivaron a 37 ° en una atmósfera húmeda y se tripsinizaron cuando alcanzaron una confluencia del 70 al 80 % utilizando 0,05 % de tripsina-EDTA (Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, EE. UU.).

En este estudio, incluimos 13 pacientes para la medición de la expresión de EpCAM en CTC. Todos estos pacientes son de nuevo diagnóstico y aún no han recibido ningún tratamiento en el momento de la recogida de la muestra. Estos pacientes (de 60 a 79 años de edad, mediana de 70 años) son todos pacientes con cáncer de próstata metastásico sensible a la castración que se incluyeron en el estudio PICTURES en curso en función de la presencia de > 2 CTC en una muestra de sangre de 7,5 ml. En uno de los experimentos de spiking se utilizó material de una paciente del estudio SIBYLLA, en el que se incluyen pacientes con cáncer de mama que completaron tratamiento endocrino adyuvante y que no presentan signos clínicos de recurrencia.

La leucoaféresis se realizó con un Terumo Spectra Optia según el procedimiento optimizado descrito por Mout et al.29. Las muestras se recolectaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki como parte de los estudios aprobados por el comité de ética médica del Centro Médico Erasmus (estudio PICTURES [MEC20-0422] y estudio SIBYLLA [MEC20-0384]). Se recolectaron muestras de sangre sana de voluntarios sanos anonimizados en un tubo de recolección CellSave (Menarini-Silicon Biosystems) en la Universidad de Twente. De acuerdo con la Declaración de Helsinki, se obtuvo el consentimiento informado de todos los voluntarios y el procedimiento de extracción de sangre utilizado fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Médica local (METC Twente).

Las expresiones se midieron en células no fijadas o cuando se indicaron en células fijadas con CellSave o formaldehído al 1%. Las expresiones se determinaron marcando el antígeno usando un anticuerpo no conjugado o conjugado con PE durante 30 min a 37°. En el caso de un anticuerpo no conjugado, las células se lavaron con PBS/BSA al 1% y se tiñeron con un anticuerpo secundario anti-ratón-PE (12-4010-87, Fisher Scientific) durante 30 min a 37°. EpCAM se midió usando el anticuerpo anti-EpCAM VU1D9 no conjugado (obsequio amable de Immunicon, Huntingdon Valley, PA, EE. UU.) o conjugado con PE VU1D9 (SAB4700425-100TST, Sigma). La expresión de Her2 se midió usando Her2 no conjugado (amable regalo de Immunicon, Huntingdon Valley, PA, EE. UU.). La expresión de PSMA se midió usando PSMA-PE (342504, BioLegend) y la citoqueratina se midió usando CK11-PE (5075S, Cell Signaling Technologies). A continuación, las células teñidas se lavaron mediante centrifugación y se resuspendieron en PBS/BSA al 1 %, después de lo cual se midió la intensidad de la señal de PE de 10 000 células en un citómetro de flujo (FACS Aria II, BD Biosciences). El número de moléculas de PE por célula se calculó utilizando el kit de cuantificación fluorescente de PE (340495, BD Biosciences). Cada tubo de este kit contiene un sedimento liofilizado de perlas conjugadas con cuatro niveles conocidos de PE. Usando la intensidad media geométrica de estas cuatro poblaciones, creamos una curva de calibración de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Usando esta curva de calibración, determinamos el número de moléculas de PE en las células medidas con el uso del valor medio geométrico. En los experimentos que contenían muestras con tinción secundaria, la intensidad de PE media geométrica de una muestra teñida usando solo el anticuerpo secundario se dedujo de las intensidades medidas para corregir la tinción no específica. En las mediciones que utilizan anticuerpos directamente conjugados, se utilizó la señal de una muestra no teñida para esta corrección.

Para comparar diferentes cultivos de las mismas líneas celulares presentes en diferentes instituciones, se congeló una alícuota de cada línea celular en nitrógeno líquido y se envió a la Universidad de Twente, mientras que también se solicitó un vial nuevo de cada línea celular en la ATCC. En la Tabla complementaria S1 se muestra una descripción general de las condiciones de cultivo y los números de pase para cada línea celular e institución. Después de la llegada, todas las células se cultivaron durante aproximadamente dos semanas en RPMI1640 (LNCaP, PC3) o DMEM (MCF7, SKBR3) (Lonza) complementado con 10 % de FBS (Sigma) y 1 % de Pen/Strep (Lonza), después de lo cual se vuelto a congelar en nitrógeno líquido en la Universidad de Twente. Para cada línea celular, todos los cultivos se descongelaron y cultivaron simultáneamente durante una o dos semanas en las mismas condiciones, después de lo cual se midió la expresión de todos los antígenos en un solo experimento.

Para ilustrar el efecto de los diferentes niveles de expresión del antígeno en la captura inmunomagnética, agregamos un número conocido de células PC3 obtenidas de diferentes instituciones en 7,5 ml de sangre de un donante sano. Para ello, las células PC3 se tiñeron con Hoechst y se llevaron a una concentración de aproximadamente 50 células por µL. Se colocaron de tres a cinco gotitas de un µl en un portaobjetos de vidrio y se tomaron imágenes. Usando estas imágenes, el número de células en cada gota se contó manualmente después del experimento. Las gotitas se enjuagaron en una muestra de sangre de 7,5 ml usando 4 ml de tampón de dilución CellSearch, después de lo cual se examinó el portaobjetos de vidrio en busca de células restantes. El enriquecimiento y la tinción posteriores se realizaron utilizando el sistema CellSearch (Menarini-Silicon Biosystems) con el kit CTC normal. Se utilizó el número de células PC3 encontradas después del escaneo y análisis con CellTracks Analyzer II (Menarini-Silicon Biosystems) para calcular la recuperación.

Para evaluar la expresión de EpCAM en CTC de pacientes con cáncer, enriquecimos CTC a partir de material DLA de 13 pacientes con cáncer de próstata mediante el agotamiento de los leucocitos. Para ello, una alícuota de una muestra de DLA obtenida en el Erasmus MC se fijó con el conservante CellSave y se envió durante la noche a la Universidad de Twente. También se procesaron alícuotas de 200 millones de glóbulos blancos (WBC) en el Erasmus MC utilizando el sistema CellSearch. Aquí se añadió PSMA como marcador adicional, lo que permitió la comparación del número de DAPI + CK + PSMA + CD45-CTC encontrados después del agotamiento de los leucocitos con el encontrado usando el sistema CellSearch. Para el agotamiento realizado en la Universidad de Twente, se incubó una alícuota de muestra que constaba de un promedio de 530 × 106 WBC (rango de 230 × 106 a 842 × 106 WBC) con CD45-biotina (4 µg/mL, producido y acoplado en nuestra institución ), CD2-biotina (555325 BD Pharmingen), CD16-biotina (555405 BD Pharmingen) y CD19-biotina (555411 BD Pharmingen) durante 15 min. Después de la adición de 9 ml de tampón de caseína (fosfato de sodio 7 mM, cloruro de sodio 41,5 mM, azida de sodio al 0,1 %, EDTA 50 mM, BSA al 0,5 %, suero de ratón al 0,2 %, caseína al 0,5 %, pH = 7,5), la muestra se lavó mediante centrifugación a 800 G durante 10 min y resuspensión en 6 ml de tampón de caseína. A esto se le añadieron estreptavidina-ferrofluidos (18 µg/mL, BioMagnetic Solutions) y la muestra se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. La separación de las células unidas se logró colocando la muestra en un imán de cuadrupolo durante 10 min. Posteriormente, la fracción no unida se eliminó utilizando una pipeta pasteur de vidrio conectada a una bomba de jeringa (aparato de Harvard). Se colocó la pipeta pasteur en el centro del tubo y se realizó la aspiración a una velocidad de 2 mL/min. La incubación magnética y la aspiración se repitieron varias veces cuando fue necesario para alcanzar un nivel de agotamiento suficiente. Para la identificación de CTC, la muestra agotada se tiñó con un cóctel de tinción que constaba de Hoechst (H3570, Invitrogen) para teñir todas las células, CK11-APC (1A-108-C100, Exbio), PSMA-PerCP/Cy5.5 (342512, BioLegend) y VU1D9-PE (SAB4700425-100TST, Sigma) para la identificación positiva de CTC y CD45-FITC (11-0459-42, eBioscience), CD16-FITC (302,006, BioLegend) y Streptavidin-FITC (S3762- 0.1MG, Merck) para teñir los glóbulos blancos restantes en la muestra agotada. Aquí, la estreptavidina-FITC se usa para teñir cualquier biotina CD2, CD16, CD19 o CD45 acoplada a las células durante el procedimiento de agotamiento, que no se haya marcado con una partícula magnética. Todos los reactivos de tinción se combinaron en un tampón que contenía saponina al 0,05 % para permeabilizar las células. Se llevaron varios controles para permitir una correcta compensación y sincronización (LNCaP y PC3-9 teñidos con CK11, PSMA, VU1D9 y Hoechst respectivamente; DLA teñidos con CD45/CD16/Estreptavidina y Hoechst respectivamente; muestras no teñidas de DLA, LNCaP y PC3 -9). A continuación, las células teñidas se lavaron y resuspendieron en PBS/BSA al 1 % y se midió la intensidad de la fluorescencia en un citómetro de flujo (FACS Aria II, BD Biosciences). Las CTC se identificaron como células CD45/CD16/Strep−, CK/PSMA+. La señal de EpCAM-PE se cuantificó con el kit de cuantificación fluorescente PE (340495, BD Biosciences); consulte también la Fig. S4 complementaria. Como procedimiento para el agotamiento, se espera que el gran fondo de células no deseadas así como la mayor complejidad de la mezcla de tinción influyan en la expresión medida de EpCAM, aumentamos el DLA de pacientes con cáncer de próstata (estudio PICTURES) o de mama (estudio SIBYLLA) con aproximadamente 10 000 células PC3 o LNCaP antes de realizar el procedimiento de agotamiento y tinción, y comparó las expresiones medidas de las células enriquecidas con las de las células no enriquecidas medidas en el mismo experimento.

La correlación entre la expresión de EpCAM y la recuperación de CellSearch se determinó después de la transformación logarítmica de la expresión de EpCAM.

Con el fin de obtener una distribución normal, las expresiones de antígeno distribuidas logarítmicamente normales se transformaron logarítmicamente y se compararon usando un ANOVA de una vía. Como la prueba de Levene indicó una varianza homogénea, realizamos la prueba de Bonferroni para determinar las diferencias estadísticas entre todos los grupos.

Al comparar la expresión de antígeno entre un solo par, se realizó una prueba t de dos muestras en datos transformados logarítmicamente.

En los casos en que se agruparon muestras pareadas de diferentes líneas celulares, antígenos o métodos de preparación, las diferencias estadísticas se determinaron utilizando la prueba no paramétrica de rangos con signos de Wilcoxon.

Para comparar la expresión EpCAM de CTC con la de diferentes líneas celulares, se utilizó la prueba no paramétrica de Kolmogorov-Smirnov para muestras no apareadas. Todos los análisis estadísticos y de correlación se realizaron con Origin 2019b (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EE. UU.) y se utilizó un umbral de significación de 0,05.

El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por los comités de ética del estudio PICTURES (MEC 20-0422) y SIBYLLA (MEC 20-0384).

Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio.

Para desarrollar, comparar y probar eficazmente los ensayos de enriquecimiento basados ​​en antígenos, la expresión del antígeno del sustituto de CTC utilizado deberá representar de manera realista las CTC reales. Aquí, la característica más importante es la expresión del antígeno objetivo. Hemos comparado la expresión del antígeno EpCAM a menudo dirigido en CTC derivadas de pacientes con cáncer de próstata con la expresión de EpCAM de varias líneas celulares bien conocidas mediante citometría de flujo cuantitativa. Aquí es importante darse cuenta de que la expresión medida de cualquier antígeno mediante citometría de flujo cuantitativa dependerá de una multitud de factores, de los cuales solo hemos mostrado un número limitado. Uno de estos factores es la relación entre el número de moléculas fluorescentes unidas a una célula y el número real de antígenos. Esta relación está determinada por la eficacia de marcaje del anticuerpo, así como por el número de moléculas fluorescentes por conjugado de anticuerpo-fluoróforo. El primero depende de varios factores, incluidos el clon de anticuerpo utilizado, la concentración de anticuerpo, el tiempo de incubación y la temperatura de incubación, pero nunca se alcanza el etiquetado completo30. Esto último se puede ver en la diferencia en la tinción de anticuerpos directa versus secundaria (Fig. 1A).

Aunque las células no fijadas son la mejor manera de medir cualquier característica celular, en la práctica, las muestras de pacientes a menudo se procesan al día siguiente. En este sentido, el uso de un fijador suave como CellSave ha demostrado ser una buena manera de preservar la expresión del antígeno, mientras que una fijación más fuerte (formaldehído) parece hacer que los antígenos sean menos accesibles para el anticuerpo de detección. Además, una fijación más fuerte hace que la permeabilización con saponina al 0,05 % sea ineficaz, lo que evita la tinción intracelular.

Como las expresiones de EpCAM medidas en CTC son relativamente bajas, también se espera que la variación experimental entre estas mediciones sea similar a la observada para PC3-9 (Fig. S2 complementaria). Sin embargo, el rango de expresión medido es relevante, considerando que la variación en La expresión de EpCAM observada entre pacientes sigue siendo mucho más baja que las diferencias de expresión de EpCAM observadas entre CTC de pacientes y algunas de las líneas celulares analizadas.

Además, en las medidas independientes tomadas a intervalos de tiempo más largos, la variación observada en la medida de celdas fijas indica que también hay variación experimental. Sin embargo, dado que las CTC de los pacientes se midieron en 13 puntos de tiempo diferentes durante el mismo período en que se midieron las expresiones de la línea celular, se espera que el efecto de esta variación experimental en ambos conjuntos de mediciones sea comparable.

Se encuentran varias diferencias en los perfiles de expresión de las mismas líneas celulares cultivadas en diferentes instituciones, en algunos casos a pesar de tener un número de pases similar y ser cultivadas usando el mismo medio de cultivo. La proliferación de diferentes subtipos de células PC3 en la Erasmus y la Universidad de Twente, por ejemplo, muestra que usar el mismo medio de cultivo no es el único factor importante. Es probable que también influyan otros factores, como la tasa de pasaje, la densidad de siembra y el tipo de matraz de cultivo.

Algunos de los CTC muestran una expresión EpCAM medida por debajo de cero. Esto se debe a la corrección aplicada a la señal de fondo presente en el citómetro de flujo. Como aplicamos una corrección fija para cada celda basada en la intensidad media geométrica de la muestra de control negativo, para aproximadamente la mitad de las celdas esta corrección será mayor que su señal de fondo real, provocando en algunos casos que la cantidad calculada de moléculas de PE por célula se vuelva negativa. De manera similar, aproximadamente la mitad de las celdas se corrigen menos que su señal de fondo real. Para mantener la variación uniformemente distribuida, hemos optado por no establecer estos valores negativos en cero.

Como puede verse en la Fig. 6, de las líneas celulares analizadas, la expresión de EpCAM de las células PC3 y PC3-9 es más similar a la de las CTC derivadas de pacientes con cáncer de próstata. El único otro estudio que, según nuestro conocimiento, ha intentado medir cuantitativamente la expresión de EpCAM en CTC es el de Rao et al.24. Sus resultados muestran una mayor expresión medida de EpCAM (49.708 antígenos por célula) en comparación con nuestros hallazgos. Sin embargo, estas expresiones no se pueden comparar directamente como Rao et al. no solo usaron CTC de pacientes con cáncer de próstata, sino que también usaron un umbral mínimo de expresión de EpCAM en su selección de CTC, excluyendo efectivamente cualquier CTC EpCAM negativo. Sin embargo, curiosamente, también determinaron que la expresión de EpCAM de la línea celular PC3-9 era adecuada como representante de CTC, lo que se debe en parte a que su cultivo de células PC3-9 tiene una expresión de EpCAM más alta en comparación con la nuestra.

Al relacionar la expresión de EpCAM de CTC con la recuperación de CellSearch mediante la regresión lineal representada en la Fig. 4, se hace evidente que, basándose únicamente en su expresión de EpCAM, la recuperación esperada de CTC para algunos pacientes está en el rango de 1 a 5 %. En estudios anteriores, hemos detectado CTC adicionales en los desechos del sistema CellSearch13, pero no hasta este punto. Esperamos que la razón de esto sea que la recuperación de CellSearch no solo depende de la expresión de EpCAM, sino que otras características como el tamaño también son importantes en la captura inmunomagnética de CTC. Por lo tanto, para ser capturadas, las células PC3 relativamente grandes probablemente necesitarán más expresión de EpCAM que una CTC de cáncer de próstata más pequeña en promedio.

En este sentido, nuestra expectativa también era ver una correlación entre la expresión de EpCAM y la recuperación relativa de CTC utilizando un enfoque de agotamiento en comparación con el enriquecimiento de CellSearch. Sin embargo, en los 13 pacientes medidos, no hemos observado tal relación (ver datos en la Tabla complementaria S2). Es probable que esto se deba en parte a la incertidumbre del nivel exacto de expresión de EpCAM en estos pacientes, así como a una variación en la pérdida de CTC durante los procedimientos de agotamiento y tinción. Otro factor que podría hacer que se midieran más CTC en algunos pacientes que usan el citómetro de flujo es su mayor sensibilidad, lo que hace que las células con igual expresión de PSMA se califiquen como PSMA negativas en CellSearch, mientras que se consideran positivas en la medición de citometría de flujo más sensible.

Aunque claramente no es el único factor de importancia, al elegir una línea celular para la optimización se debe tratar de usar una o más líneas celulares en el rango de expresión que se mide en CTC reales. Como se puede ver en la Fig. 3, esto no significa que las células PC3 compradas en la ATCC sean adecuadas como equivalentes de CTC de baja expresión, ya que su expresión está en la parte superior de lo que se mide en CTC reales. Esta diferencia también muestra la necesidad de la cuantificación regular de la expresión del antígeno si se van a realizar comparaciones utilizando líneas celulares.

En este trabajo, hemos demostrado que la comparación de métodos de enriquecimiento celular basados ​​en antígenos en diferentes instituciones que utilizan las mismas líneas celulares puede generar grandes diferencias en la eficiencia de captura, ya que las líneas celulares cultivadas en diferentes instituciones muestran una gran variación en la expresión del antígeno. Idealmente, se utiliza una línea celular con una expresión comparable a las CTC reales. Para EpCAM, mostramos una expresión en CTC que difiere entre los pacientes con cáncer de próstata sensibles a la castración, pero es mucho más baja que muchas de las líneas celulares que se usan a menudo para evaluar las tecnologías de enriquecimiento de CTC.

Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Todos los datos de citometría de flujo utilizados en este manuscrito están disponibles en formato de archivo estándar .fcs. Las imágenes utilizadas para el recuento de células enriquecidas, así como los escaneos de CellSearch utilizados para evaluar la recuperación, están disponibles en el formato .tiff original.

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Descargar referencias

Agradecemos al Erasmus MC Rotterdam, el Instituto de Investigación del Cáncer de Londres y la Universitäts Klinikum Düsseldorf por proporcionarnos varias líneas celulares de cáncer de mama y próstata. También agradecemos al Erasmus MC Rotterdam por proporcionar una alícuota de muestra procedente del estudio SIBYLLA. Agradecemos al GEDNAP Proficiency Tests Institute for Forensic Science (Münster) por realizar el análisis STR.

Esta investigación fue financiada en parte por el programa NWO/KWF PICTURES (17915).

Grupo de Biofísica Celular Médica, Centro Techmed, Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad de Twente, PO Box 217, 7500 AE, Enschede, Países Bajos

Anouk Mentink, Leon WMM Terstappen y Michiel Stevens

Departamento de Oncología Médica, Instituto de Cáncer Erasmus MC, Centro Médico de la Universidad Erasmus, Róterdam, Países Bajos

Khrystany T. Isebia y Jaco Kraan

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Conceptualización, LT; diseño, AM, MS, LT; análisis, AM, MS; adquisición, AM, KTI, JK, MS; escritura, AM, MS; revisión y edición, AM, KTI, JK, LT, MS; visualización, AM, MS; supervisión, MS, LT

Correspondencia a Michiel Stevens.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mentink, A., Isebia, KT, Kraan, J. et al. Medición de la expresión de antígenos de líneas celulares cancerosas y células tumorales circulantes. Informe científico 13, 6051 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33179-y

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Recibido: 02 Diciembre 2022

Aceptado: 08 abril 2023

Publicado: 13 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33179-y

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