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Mar 18, 2023

Los análogos de 25OHD y los tubos de extracción de sangre al vacío afectan drásticamente la precisión de los inmunoensayos automatizados

Informes científicos volumen 5,

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 14636 (2015) Citar este artículo

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Las variaciones en los métodos de cuantificación de la vitamina D son grandes y no se han examinado sistemáticamente las influencias de los análogos de la vitamina D y los métodos de extracción de sangre. Evaluamos los efectos de los análogos de vitamina D 25OHD2 y 3-epi 25OHD3 y los métodos de extracción de sangre en la medición de vitamina D, utilizando cinco sistemas de inmunoensayo y cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Las muestras de suero (332) se seleccionaron de solicitudes de análisis de vitamina D de rutina, incluidas muestras con o sin 25OHD2 o 3-epi 25OHD3, y se analizaron mediante varios sistemas de inmunoensayo. En muestras sin 25OHD2 o 3-epi 25OHD3, todos los inmunoensayos se correlacionaron bien con LC-MS/MS. Sin embargo, el sistema de Siemens produjo un gran sesgo medio positivo de 12,5 ng/mL y un valor de Kappa bajo cuando se usaron tubos con activador de coágulos y separador de gel. Cuando estaba presente 25OHD2 o 3-epi 25OHD3, las correlaciones y la concordancia clínica disminuyeron para todos los inmunoensayos. El 25OHD en suero en tubos VACUETTE con gel y activador de coágulos, medido por el sistema Siemens, produjo valores significativamente más altos que las muestras recolectadas en tubos VACUETTE sin aditivos. El sesgo disminuyó y el acuerdo clínico mejoró significativamente al usar tubos sin aditivos. En conclusión, la mayoría de los inmunoensayos automatizados mostraron una correlación y concordancia aceptables con LC-MS/MS; sin embargo, los análogos de 25OHD y los tubos de extracción de sangre afectaron drásticamente la precisión.

La evidencia reciente de la asociación entre la vitamina D y la enfermedad ósea1, la diabetes2, las enfermedades autoinmunes3, las enfermedades cardiovasculares4 y el cáncer5, junto con el reconocimiento de que la deficiencia de vitamina D es común, ha llevado a un aumento masivo de las pruebas de vitamina D en todo el mundo1,6,7. Por ejemplo, en la clínica Mayo, las pruebas de deficiencia de vitamina D han aumentado entre un 80 % y un 90 % por año6 y en nuestro laboratorio, la cantidad de pruebas realizadas se ha duplicado en los últimos dos años. Debido a este aumento de la carga de trabajo, recientemente se han desarrollado inmunoensayos automatizados. Sin embargo, existe una gran variación entre los métodos utilizados para evaluar los niveles de vitamina D6,8,9.

La 25 hidroxivitamina D (25OHD) circulante es la forma predominante de vitamina D y generalmente se considera el biomarcador más confiable de la concentración sérica de vitamina D10. 25OHD3 y 25OHD2 son los dos tipos principales de 25OHD: 25OHD3 se produce endógenamente en animales en la piel en respuesta a la exposición al sol y se puede obtener en la dieta a través de suplementos que contienen 25OHD3. 25OHD2 se encuentra en los hongos. Tanto el 25OHD2 como el D3 se pueden usar en suplementos o como aditivos en alimentos como los productos lácteos1. Sin embargo, recientemente se ha identificado 3-epi 25OHD3, un epímero de 25OHD3. Si bien la bioactividad de este análogo aún no está clara11,12, se ha demostrado que 3-epi 25OHD3 causa reactividad cruzada con 25OHD3 en inmunoensayos, lo que lleva a una sobreestimación de los niveles de 25OHD.

Se han desarrollado varios inmunoensayos automatizados para la detección de 25OHD. Sin embargo, se ha informado que la variación entre laboratorios llega al 38 %6,8,13. Además, la definición de deficiencia de vitamina D sigue siendo controvertida, con grandes variaciones entre los métodos que contribuyen a la controversia. También se espera que estas grandes variaciones sean problemáticas para las aplicaciones de diagnóstico clínico que utilizan el mismo punto de corte para la deficiencia de vitamina D para diferentes métodos. Por lo tanto, se debe evaluar la uniformidad clínica de los diferentes métodos.

La cromatografía líquida de dilución de isótopos y la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) se consideran el estándar de oro y el método de referencia para las pruebas de 25OHD14. Sin embargo, los enfoques de LC-MS/MS utilizados con mayor frecuencia y los que formaron la base para comparar métodos no han incluido la separación de 3-epi 25OHD3 de 25OHD3 porque requeriría un análisis cromatográfico que consumiría mucho tiempo, lo que disminuiría la eficiencia de detección; solo en estudios aislados se ha medido 3-epi 25OHD3 mediante LC-MS/MS14,15.

Varios estudios han comparado métodos para la detección de vitamina D en los últimos años; sin embargo, es controvertido si tales métodos cumplen con los estándares de rendimiento. En 2012, Farrell et al.8 compararon el rendimiento de cinco inmunoensayos automatizados con LC-MS/MS y concluyeron que el sistema de Roche no cumplió con los objetivos mínimos de rendimiento, mientras que Ajuria-Morentin et al.9 informaron que el sistema de Siemens tenía el mayor sesgo en comparación con LC-MS/MS, sin una explicación clara de este sesgo. Tanto los suplementos de vitamina D2 como de vitamina D3 se usan mucho en China y los Estados Unidos de América (EE. UU.), la identificación de concentraciones significativas de 25OHD2 y 3-epi 25OHD311 en circulación ha llevado a algunos fabricantes, como Roche, a actualizar sus productos para mejorar eficiencia de detección y cuantificación para distintos análogos. Sin embargo, estos nuevos inmunoensayos pueden estar limitados por la reactividad cruzada de los anticuerpos y el reconocimiento no equimolar de 25OHD2 y 25OHD3. Además, ningún estudio ha evaluado los efectos de 25OHD2 y 3-epi 25OHD3 en el rendimiento de la última generación de sistemas de inmunoensayo de 25OHD. Como complicación adicional de la medición precisa de 25OHD, el uso de tubos de recolección de sangre al vacío no está estandarizado y los diferentes tubos de recolección pueden afectar la precisión de los inmunoensayos.

En este estudio, comparamos cinco inmunoensayos automatizados, incluidos Roche Cobas E601 (Roche Diagnostics (Shanghai) Ltd., Basilea, Suiza), Siemens ADVIA Centaur XP (Siemens Healthcare Diagnostics (Shanghai) Co., Walpole, EE. UU.), DiaSorin Liaison XL ( DiaSorin, Saluggia, Italia), Abbott Architect I4000 (Abbott Diagnostics, Deerfield, IL, EE. UU.) e IDS-iSYS (IDS France, Pouilly en Auxois, Francia) con un método de referencia LC-MS/MS para evaluar los efectos de 25OHD2 y 3-epi 25OHD3 sobre la precisión de los cinco inmunoensayos automatizados y para determinar la influencia de los aditivos en los tubos de extracción de sangre al vacío en la detección de 25OHD.

De abril a junio de 2014, se recolectaron 332 muestras de suero de 106 hombres y 226 mujeres, con edades comprendidas entre los 6 meses y los 93 años (media ± SD; 46 ± 22 años), de las solicitudes de análisis de vitamina D de rutina. Las muestras se recogieron utilizando tubos VACUETTE de 4 ml con gel y activador de coágulos (REF: 454067; Greiner Bio-one, Kremsmunster, Austria), incluidas 166 muestras de suero que contenían 25OHD3 (4,3–57,4 ng/ml), 111 muestras de suero que contenían 25OHD2 ( 2,5–78,4 ng/mL), 31 muestras de suero que contenían 3-epi 25OHD3 (2,2–8,8 ng/mL) y 24 muestras que contenían tanto 25OHD2 (3,2–18,8 ng/mL) como 3-epi 25OHD3 (2,2–5,4 ng/mL ), así como 25OHD3. En el momento de este estudio, LC-MS/MS se utilizó en nuestro laboratorio y sirvió para seleccionar las muestras para este estudio. Las muestras de suero se dividieron en seis alícuotas y se almacenaron a -80 °C para garantizar la estabilidad hasta el análisis16,17.

Para la investigación de los posibles efectos de los aditivos en los tubos de extracción de sangre al vacío en la medición de 25OHD, se reclutaron 77 voluntarios sanos y se recolectaron muestras de sangre en ayunas de cada individuo mediante venopunción en tubos VACUETTE de 4 ml sin aditivos (REF: 454001; Greiner Bio- uno); Luego, las muestras se centrifugaron dentro de las 2 h (1200 × g, 10 min) y se analizaron inmediatamente utilizando sistemas de inmunoensayo automatizados y LC-MS/MS.

Utilizamos LC-MS/MS para medir 25OHD y evaluar los cinco sistemas de inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizados. Además, se prepararon tres grupos de suero para la evaluación de la precisión del ensayo. El método LC-MS/MS demostró concentraciones medias de 25OHD de 6,2, 16,0 y 22,1 ng/ml, respectivamente, para los tres grupos, con concentraciones de 25OHD2 y 3-epi 25OHD3 inferiores a 2,5 ng/ml. Se prepararon múltiples alícuotas de los tres grupos y se almacenaron a -80 °C. Durante 5 días consecutivos, se ensayó cuatro veces una alícuota recién descongelada de cada conjunto utilizando todos los métodos.

El estudio había sido revisado y aprobado por el Comité de Ética del Peking Union Medical College Hospital y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas. Todos los individuos estudiados fueron informados por escrito del uso previsto de sus muestras y cada uno proporcionó su consentimiento por escrito.

LC-MS/MS se realizó utilizando un sistema Waters ACQUITY UPLC (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.) junto con un sistema AB Sciex 4000 QTrap (Sciex Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). El protocolo para la preparación de la muestra fue el siguiente. Las muestras de suero, los calibradores y los controles se trataron con hidróxido de sodio 0,1 mM y se precipitaron con solución de sulfato de zinc 1 mM y patrones internos de isótopos marcados con deuterio que contenían metanol. El 25OHD finalmente se extrajo con hexano, se agitó a fondo y luego se centrifugó durante 10 min a 4 °C a 3148 × g. Luego, la fase superior de hexano se transfirió a viales de vidrio y se secó bajo nitrógeno a 40 °C durante 25 min y el residuo seco se reconstituyó en 150 μl de metanol/agua (70:30) y se cargó en el sistema LC-MS/MS. La separación cromatográfica por LC-MS/MS se realizó utilizando una columna analítica Phenomenex Kinetex PFP (100 × 3,0 mm, 2,6 μm; Phenomenex Inc. Torrance, CA, EE. UU.) con metanol como fase móvil A y ácido fórmico al 0,1 % en agua como fase móvil. fase B. El gradiente isocrático fue el siguiente: 0-2,0 min, 70% A; 2,0–5,0 min, 70 %–75 % A; 5,0–6,5 min, 75% A; 6,5–10,0 min, 75%–80% A; 10,0–11,0 min, 80% A; 11,01–12,0 min, 90% A; y 12,01–13,0 min, 70 % A. El caudal fue de 0,5 ml/min. El horno de la columna se mantuvo a 45 °C durante todo el análisis. El análogo deuterado de 25OHD3 se usó como estándar interno para 3-epi 25OHD3 y 25OHD3 y el análogo deuterado de 25OHD2 se usó como estándar interno para 25OHD2. La detección MS/MS se hizo funcionar en modo de ionización por electropulverización positiva. Se usó el modo de operación de monitoreo de reacción múltiple (MRM) y las transiciones de MRM usadas para cada analito fueron las siguientes: m/z 413,3 → 395,3 (25OHD2), 401,4 → 383,4 (25OHD3), 416,3 → 398,3 (estándar interno 25OHD2, [ 2H]3-25OHD2) y 404,4 → 386,4 (estándar interno 25OHD3, [2H]3-25OHD3). Las curvas de calibración se construyeron trazando la relación de las áreas de los picos de cromatografía para 25OHD2 y 25OHD3 y sus respectivos estándares internos frente a las concentraciones conocidas, seguido de una regresión lineal para ajustar los datos. Los límites de cuantificación (LOQ) para 25OHD2 y 25OHD3 fueron 1,8 y 1,2 ng/mL, respectivamente. El nivel específico de 3-epi 25OHD3 se cuantificó utilizando la calibración de 25OHD3 y [2H]3-25OHD3 como patrones internos. En la Figura complementaria 1 se muestra un cromatógrafo representativo. El rango de linealidad para 25OHD3 y 25OHD2 fue de 2,5 a 200 ng/mL y ambas curvas de calibración produjeron un coeficiente de correlación superior a 0,999. La precisión se validó mediante el análisis del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) SRM 972a. En comparación con los valores de referencia de SRM 972a, la precisión de LC-MS/MS para las mediciones de 25OHD2, 25OHD3 y 3-epi 25OHD3 fue de 104,5 %–106,8 %, 99,5 %–105,9 % y 108,0 %–109,9 %, respectivamente. La recuperación se estimó añadiendo dos niveles de 25OHD2 y 25OHD3 a las muestras de suero y analizándolas por triplicado. La recuperación se calculó como la relación entre el valor medido y la cantidad de estándar utilizada para enriquecer la muestra. Las recuperaciones medias de 25OHD2 y 25OHD3 fueron todas cercanas al 100 %. La precisión se evaluó analizando tres niveles de muestras de control de calidad de Bio-Rad (LiquichekTM Specialty Immunoassay Control, LOT: 57440). Los coeficientes de variación (CV) totales para 25OHD2 y 25OHD3 fueron 4,34 % (2,88 %–7,01 %) y 2,82 % (2,45 %–3,21 %), respectivamente.

Los métodos de inmunoensayo se realizaron en las plataformas Roche, Siemens, DiaSorin, Abbott e IDS, incluida Roche Elecsys Vitamin D Total (Lote: 171102, Instrucciones de uso (IFU) versión: 06268668001V1,02/2011), Siemens ADVIA Centaur Vitamin D Total ( Lotes: 39566029, 10631021; versión IFU: 10699313, 08/2012), DiaSorin Liaison XL Total Vitamin D (Lote: 131192E; versión IFU: zh310600 43005, 09/2014), Abbott Architect 25-OHD Vitamin D (Lote: 02614E00 0; Versión IFU:49-8941/R02,05/2012) e IDS-iSYS (Lote:1996; Versión IFU: IS-2700SPL V02,05/2014), respectivamente.

Los datos se analizaron mediante regresión de Passing-Bablok y gráficos de Bland-Altman para evaluar las comparaciones entre métodos. Se utilizó la prueba t pareada para comparar los resultados de 25OHD entre métodos. El punto de corte para la deficiencia de vitamina D fue de 20 ng/mL1,18. La concordancia entre los métodos se evaluó mediante la concordancia entre evaluadores (valores Kappa)9. Se calcularon los coeficientes Kappa para evaluar el nivel de concordancia entre diferentes métodos para identificar hipovitaminosis clínicamente relevante (20 ng/mL). Los valores de Kappa superiores a 0,6 fueron indicativos de concordancia, mientras que los valores superiores a 0,8 indicaron una excelente concordancia9. La precisión se expresó como el porcentaje de individuos con 25OHD medido por inmunoensayo dentro del 15% (P15) o 30% (P30) de 25OHD medido por LC-MS/MS. Los valores de P15 y P30 de los cinco inmunoensayos se compararon entre sí mediante la prueba de McNemar. Los análisis estadísticos se realizaron con Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, EE. UU.) y MedCalc Statistical Software (versión 13.3.3, Broekstraat, Mariakerke, Bélgica).

Si bien todos los inmunoensayos detectaron 25OHD2, las eficiencias variaron. Solo DiaSorin logró una eficiencia de detección del 100 % para la detección de 25OHD3 (Tabla 1). La mayoría de los inmunoensayos exhibieron menos del 3% de reactividad cruzada con 3-epi 25OHD3; sin embargo, el sistema Roche fue menos eficiente en la separación de 3-epi 25OHD3 de 25OHD3, exhibiendo una reactividad cruzada del 91 %. Curiosamente, el sistema de Roche tenía un rango de medición analítico relativamente estrecho (3–70 ng/mL). Por el contrario, los sistemas de Roche y DiaSorin tenían una precisión relativamente mejor que las otras plataformas, con CV e interCV inferiores al 5 %.

Del total de muestras, la media ± SD 25OHD fue la siguiente (Fig. 1): 25,5 ± 12,0 ng/mL (LC-MS/MS), 24,6 ± 12,7 ng/mL (Abbott), 21,7 ± 11,1 ng/mL ( DiaSorin), 25,4 ± 9,9 ng/ml (IDS), 23,9 ± 12,5 ng/ml (Roche) y 39,5 ± 19,8 ng/ml (Siemens). La prueba t pareada mostró que el resultado del sistema Siemens fue significativamente más alto que el resultado de LC-MS/MS (P < 0.05), mientras que los resultados de los inmunoensayos DiaSorin, Roche y Abbott fueron más bajos que los resultados de LC-MS/MS ( Pruebas T pareadas, P < 0,05). La precisión, estimada por P15 y P30, mostró que los sistemas de Abbott, DiaSorin, IDS y Roche no diferían significativamente entre sí (P15: 43,67 %, 49,70 %, 45,18 % y 48,80 %, respectivamente, prueba de McNemar, p > 0,05 ; P30: 76,20 %, 81,93 %, 76,81 % y 75,60 %, respectivamente, prueba de McNemar, p > 0,05), pero sus valores de precisión fueron significativamente superiores a los del sistema Siemens (P15: 14,76 %; P30: 27,11 %, prueba de McNemar prueba, p < 0,01).

Diagrama de caja y bigotes que muestra la distribución de los resultados de todos los ensayos analizados en un total de 332 muestras de suero.

Los cuadros centrales representan el rango de percentil 25 a 75. Las líneas dentro de los recuadros muestran el valor de la mediana y el IC del 95 % para el valor de la mediana para cada método probado. Los bigotes se extienden desde el valor mínimo hasta el máximo, excluyendo los valores atípicos. Un valor atípico se define como un valor que supera el cuartil superior o inferior más o menos 1,5 veces el rango intercuartílico.

La mayoría de los inmunoensayos (excepto Siemens) mostraron una concordancia diagnóstica aceptable con LC-MS/MS (Kappa > 0,6), mientras que Roche tuvo el mejor valor de Kappa (Tabla 2). Cuando no hubo 25OHD2 o 3-epi 25OHD3 detectable, todos los inmunoensayos, excepto Siemens, estuvieron en excelente acuerdo. Cuando los machos y las hembras se analizaron por separado, los resultados del inmunoensayo de 25OHD produjeron una tendencia similar a la observada en la muestra total (Tabla complementaria 1).

Además, considerando las diferencias entre los métodos, utilizamos modelos de regresión (calculados a partir del total de muestras) para transferir los puntos de corte para los métodos de inmunoensayo. Después de la transferencia, los puntos de corte para la definición de hipovitaminosis D fueron 20 (Abbott), 17 (DiaSorin), 21 (IDS), 19 (Roche) y 31 ng/mL (Siemens), respectivamente. Utilizando estos puntos de corte transferidos, Siemens mostró la mayor mejora en el valor de Kappa (aumentó de 0,410 a 0,637) y la mayoría de los inmunoensayos mostraron una concordancia aceptable y mejorada con LC-MS/MS (Tabla 2).

Aunque se suponía que el sistema DiaSorin detectaría 25OHD con un 100 % de eficiencia y especificidad para 25OHD3, el coeficiente de correlación disminuyó, el sesgo aumentó y el valor de Kappa disminuyó significativamente cuando las muestras contenían 25OHD2 o 3-epi 25OHD3 (Fig. 2). Los otros cuatro inmunoensayos exhibieron una tendencia similar (Tabla 2). El nivel de 25OHD2 se correlacionó significativamente con el sesgo entre los métodos de inmunoensayo (para Abbott, DiaSorin, IDS, Roche y Siemens: r = 0,848, 0,909, 0,834, 0,849 y 0,282, respectivamente) y LC-MS/MS (Figura 2 complementaria). Y se demostró que cuando no había 25OHD2, el porcentaje de sesgo en el nivel de decisión médica de Roche era el más pequeño; sin embargo, cuando había 25OHD2, el porcentaje de sesgo en el nivel de decisión médica aumentaba significativamente (Tabla complementaria 2).

Comparación de DiaSorin y LC-MS/MS.

A–E son análisis de regresión de Passing-Bablok para 166 muestras de suero que contienen solo 25OHD3, 111 muestras de suero que contienen tanto 25OHD3 como 25OHD2, 31 muestras de suero que contienen 25OHD3 y las 332 muestras de suero, respectivamente. F–J son diagramas de Bland-Altman que muestran el sesgo entre DiaSorin y LC-MS/MS para 166 muestras de suero que contienen solo 25OHD3; 111 muestras de suero que contenían 25OHD3 y 25OHD2; 31 muestras de suero que contenían 25OHD3; 24 muestras que contenían 25OHD3, 25OHD2 y 3-epi 25OHD3; y las 332 muestras de suero, respectivamente.

A continuación, para aclarar si los tubos de extracción de sangre al vacío afectaron la precisión de los inmunoensayos, analizamos 10 muestras después de la extracción de sangre en tubos VACUETTE de 4 ml sin aditivos y tubos VACUETTE de 4 ml con gel y activador de coágulos y analizamos todas las muestras mediante el cinco inmunoensayos y LC-MS/MS. Los resultados se muestran en la Fig. 3 y se demostró que las muestras recolectadas en tubos VACUETTE de 4 mL con gel y activador de coágulos exhibieron valores aparentemente más altos que las muestras en tubos sin aditivos (sesgo medio (DE): 12,7 (4,3) ng/mL , P < 0.01) utilizando el sistema Siemens. Se reclutaron 67 voluntarios adicionales y su suero se recolectó en tubos sin aditivos VACUETTE de 4 ml y para el total de 77 muestras recolectadas en tubos sin aditivos VACUETTE de 4 ml se analizaron tanto por el sistema Siemens como por LC-MS/MS y el coeficiente de correlación entre los dos métodos mejoró, el sesgo disminuyó significativamente y con una pendiente cercana a 1, indicó concordancia (Kappa = 0.68) (Fig. 4).

Sesgo entre los resultados de 25OHD en tubos VACUETTE de 4 ml con gel y activador de coágulos y en tubos VACUETTE de 4 ml sin aditivos de cada método.

Eje X: números de muestra; Eje Y: 25OHD da como resultado tubos VACUETTE de 4 ml con gel y activador de coágulos menos 25OHD da como resultado tubos VACUETTE de 4 ml sin aditivos.

Comparación de resultados de 25OHD para Siemens y LC-MS/MS en tubos VACUETTE de 4 ml con gel y activador de coágulos y tubos VACUETTE de 4 ml sin aditivos.

A y B son gráficos de regresión de Passing-Bablok y Bland-Altman de 332 muestras de 25OHD analizadas con Siemens y LC-MS/MS para sangre recolectada en tubos VACUETTE de 4 ml con gel y activador de coágulos; C y D son gráficos de regresión de Passing-Bablok y Bland-Altman de 77 muestras de 25OHD analizadas con Siemens y LC-MS/MS para sangre recolectada en tubos VACUETTE de 4 ml sin aditivos.

En este estudio, examinamos las diferencias en las precisiones de cinco sistemas de inmunoensayo diferentes para el análisis de vitamina D y análogos de vitamina D en muestras de sangre de 332 personas. Nuestros datos demostraron que la mayoría de los sistemas, con la excepción del sistema Siemens, mostraron buena aceptabilidad y precisión. Además, con el sistema Siemens, el uso de tubos de extracción de sangre particulares afectó sustancialmente los resultados y resumimos los efectos de los análogos de 25OHD y los tubos VACCUTTE para los inmunoensayos en la Tabla complementaria 3. Estos datos tienen implicaciones en el desarrollo y la aplicación posteriores de ensayos para medir niveles de vitamina D.

En los últimos años, varias organizaciones han llevado a cabo estudios de estandarización de la vitamina D, como el Programa de certificación y estandarización de la vitamina D (CDC VDSCP) de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. Programa de Estandarización (VDSP) establecido en 2010 por la Oficina de Suplementos Dietéticos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU., el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) de EE. UU. y el Laboratorio de Química Analítica de Bélgica (Gante, Bélgica)19,20. Estas organizaciones también han impulsado la mejora de los productos de vitamina D para lograr una detección eficiente de 25OHD2 y 25OHD3, así como de 3-epi 25OHD3. Sin embargo, hasta donde sabemos, pocos estudios se han centrado en los efectos de 25OHD2 y 3-epi 25OHD3 en los métodos de inmunoensayo. Por lo tanto, nuestro estudio actual fue el primero en comparar los efectos de 25OHD2 y 3-epi 25OHD3 en la precisión y exactitud de varios inmunoensayos.

En los últimos años, los investigadores han comparado diferentes métodos para la detección de 25OHD; sin embargo, aunque en algunos estudios se encontraron altas correlaciones entre los métodos, no fue posible determinar de forma consistente el mejor método. Farrell et al.8 informaron que todos los métodos de inmunoensayo probados estaban altamente correlacionados con LC-MS/MS, con un coeficiente de regresión superior a 0,9, pero el sistema de Roche produjo el coeficiente de correlación más bajo (r = 0,679); de hecho, el ensayo utilizado en el estudio anterior solo pudo detectar 25OHD3. Sin embargo, con un enfoque en la vitamina D2, Roche ha mejorado sus productos para la detección de 25OHD2 y 25OHD3 y utilizamos el ensayo mejorado en nuestro experimento. En un informe anterior21, se demostró que Siemens, DiaSorin y Roche producían correlaciones similares y aceptables con LC-MS/MS, mientras que Koivula et al.22 informaron que los sistemas Abbott, DiaSorin, IDS y Siemens produjeron coeficientes de regresión deficientes y solo Siemens y los sistemas IDS estaban en buena concordancia clínica con LC-MS/MS. Sin embargo, Ajuria-Morentin et al.9 demostraron que el sistema de Siemens produjo la correlación más pobre y el mayor sesgo en comparación con los otros métodos de inmunoensayo, de acuerdo con nuestros resultados.

Las diferencias sustanciales entre los métodos de inmunoensayo pueden estar relacionadas, en parte, con sus diferentes capacidades para la medición de 25OHD2 y 3-epi 25OHD3. Aunque todos los fabricantes afirmaron que sus métodos de inmunoensayo podían detectar 25OHD2, y DiaSorin afirmó que su anticuerpo tenía la misma eficiencia molar para 25OHD2 y 25OHD3, todos los coeficientes de regresión disminuyeron cuando las muestras contenían 25OHD2 y el sesgo entre los métodos de inmunoensayo y LC-MS/MS se correlacionó. significativamente con el nivel de 25OHD2. Actualmente, tanto los suplementos de vitamina D2 como los de vitamina D3 se utilizan en China y los EE. UU., lo cual es problemático para diagnosticar la deficiencia de vitamina D, ya que nuestros resultados indican que la consistencia de la medición de 25OHD2 mediante inmunoensayos comunes podría no ser satisfactoria. Estos resultados fueron inconsistentes con los resultados de un estudio realizado por Le Goff et al., quienes mostraron que solo los sistemas de Abbott y Siemens produjeron una reactividad insatisfactoria con 25OHD223. Además, aunque todos los fabricantes (excepto Roche) afirmaron que sus ensayos tenían poca reactividad cruzada con 3-epi 25OHD3, nuestros resultados mostraron que para todos los inmunoensayos probados, la correlación con LC-MS/MS disminuyó significativamente cuando las muestras contenían 3-epi 25OHD3 . Los niveles de 3-epi 25OHD3 en nuestras muestras fueron relativamente bajos en relación con el total de 25OHD. Por un lado, esto puede respaldar la idea de que no se esperaría que 3-epi 25OHD3 afectara rutinariamente a los métodos de LC-MS/MS que no podían distinguir y separar 3-epi 25OHD3 de 25OHD324. Por otro lado, dados los bajos niveles de 3-epi 25OHD3 presentes en las muestras, tuvo un efecto relativamente significativo en los resultados del inmunoensayo. Por lo tanto, los bajos niveles y la poca frecuencia de 3-epi 25OHD3 en las muestras de nuestro estudio representan una importante limitación de nuestro trabajo. Los estudios futuros deberían examinar los efectos del aumento de las concentraciones de 3-epi 25OHD3 en las muestras.

Estudios anteriores han demostrado que es necesario que los laboratorios desarrollen protocolos e intervalos de referencia específicos del sitio para lograr resultados consistentes9. Además, nuestros resultados respaldan la propuesta de que los intervalos de referencia específicos del sitio son necesarios para mejorar la uniformidad; sin embargo, el grado de mejora dependía de la plataforma. Por ejemplo, los sistemas de Siemens mejoraron más que los otros métodos cuando los valores de corte se transfirieron de acuerdo con la ecuación de regresión.

El punto de corte para la deficiencia de vitamina D ha sido un tema controvertido25. IOM recomienda que 12 ng/mL pueden satisfacer los requisitos necesarios para adultos normales26. Por el contrario, los endocrinólogos revisaron muchos estudios sobre la vitamina D y concluyeron que 20 ng/mL era un mejor límite para la definición de deficiencia de vitamina D18. Según nuestros resultados, la controversia puede verse exacerbada por los diferentes métodos de inmunoensayo utilizados en varios estudios. En el futuro, será necesario definir la deficiencia de vitamina D en base a trabajos que utilicen un método de referencia, como LC-MS/MS. Sin embargo, considerando el gran sesgo producido por Siemens, detectado en el presente estudio y por otros9, se espera que este sistema particular de Siemens produzca resultados variables en presencia de análogos de vitamina D y sea sensible al valor de corte utilizado. Siemens aprobó el primer programa de estandarización hormonal para la vitamina D organizado por los CDC de EE. UU. en octubre de 2014. El programa de estandarización permite un sesgo medio dentro del 5 % como criterio de aceptación y Siemens Healthcare Diagnostics, junto con IDS, son los únicos métodos de inmunoensayo certificados. Por tanto, los resultados de nuestro estudio y el de Ajuria-Morentin et al.9 son algo confusos en este contexto. Aunque Borai informó que los tubos separadores de suero BD no afectaron a los inmunoensayos de Abbott y DiaSorin en la medición de 25OHD327, los efectos de los tubos de extracción de sangre VACUETTE en el inmunoensayo de Siemens no estaban claros. En nuestro análisis, encontramos que el uso de un tubo VACUETTE con gel y activador de coágulos, que se usa comúnmente en nuestro hospital para medir 25OHD, resultó en mediciones significativamente más altas que las muestras recolectadas en tubos sin aditivo usando el sistema Siemens. Sin embargo, es importante destacar que LC-MS/MS no produjo un sesgo significativo debido al tipo de tubo utilizado. Los resultados de 25OHD para muestras de sangre recolectadas en tubos VACUETTE sin aditivos mostraron un rendimiento excelente en comparación con LC-MS/MS. Las razones de estas observaciones no se entienden. Es posible que el activador de coágulos, el gel de separación o algunos otros elementos del tubo VACUETTE de 4 ml con gel y activador de coágulos aumentaran la reactividad cruzada inespecífica entre los anticuerpos marcados con partículas magnéticas y el éster de acridinio, lo que provocaría un aumento de los valores de quimioluminiscencia. Estas posibilidades no pueden dilucidarse por completo ya que los fabricantes de tubos y Siemens mantienen la confidencialidad con respecto a las composiciones específicas de sus productos. Por lo tanto, aunque no se conocen los efectos específicos, particularmente con el sistema Siemens, será importante determinar qué tubos de recolección de sangre son apropiados para un uso confiable. Nuestros resultados destacan la necesidad de evaluar los efectos de los tubos de extracción de sangre al elegir los inmunoensayos 25OHD. Se necesitan más estudios para aclarar los mecanismos a través de los cuales el tubo de extracción de sangre interfiere con la medición de 25OHD utilizando el sistema Siemens.

En resumen, nuestros resultados mostraron que la mayoría de los inmunoensayos automatizados tenían una correlación y concordancia aceptables con LC-MS/MS cuando no había 25OHD2 o 3-epi 25OHD3 detectables. Sin embargo, la presencia de 25OHD2 o 3-epi 25OHD3 tuvo efectos sustanciales en los resultados de los métodos de inmunoensayo. Por lo tanto, al definir el valor de corte para la deficiencia de vitamina D, se debe considerar la diferencia entre los métodos. Además, cuando se utiliza el sistema Siemens, es esencial utilizar tubos de extracción de sangre al vacío adecuados para medir 25OHD en laboratorios clínicos o para investigaciones epidemiológicas.

Cómo citar este artículo: Yu, S. et al. Los análogos de 25OHD y los tubos de extracción de sangre al vacío afectan drásticamente la precisión de los inmunoensayos automatizados. ciencia Rep. 5, 14636; doi: 10.1038/srep14636 (2015).

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Descargar referencias

Los autores desean agradecer a los fabricantes, incluidos Siemens, IDS, DiaSorin, Roche y Abbott, por su apoyo en el suministro de reactivos y asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Programa Nacional de Materias Clínicas Clave de China y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de Alta Tecnología de China (Programa 863, 2014AA022304) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81201337, 81171665). Los organismos de financiación no participaron en la realización de este trabajo o en los análisis realizados y no participaron en la decisión de publicar.

Yu Songlin, Cheng Xinqi y Fang Huiling contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Laboratorio Clínico, Peking Union Medical College Hospital, Academia China de Ciencias Médicas, Beijing, 100730, China

Songlin Yu, Xinqi Cheng, Huiling Fang, Jianhua Han, Xuzhen Qin, Qian Cheng, Wei Su, Li'an Hou, Liangyu Xia y Ling Qiu

Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital China-Japón, Beijing, 100029, China

arruinar zhang

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QL diseñó la investigación; YS y FH contribuyeron a la adquisición, análisis e interpretación de datos, así como a la redacción del artículo; CX, ZR, HJ, QX, HL, SW, XL y CQ realizaron la investigación, reclutaron a los sujetos, analizaron las muestras y recopilaron los datos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Yu, S., Cheng, X., Fang, H. et al. Los análogos de 25OHD y los tubos de extracción de sangre al vacío afectan drásticamente la precisión de los inmunoensayos automatizados. Informe científico 5, 14636 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14636

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Recibido: 02 junio 2015

Aceptado: 02 de septiembre de 2015

Publicado: 30 de septiembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14636

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