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Nov 13, 2023

El trasplante de mitocondrias exógenas mejora la supervivencia y los resultados neurológicos después de la reanimación de un paro cardíaco

Volumen de medicina BMC

BMC Medicine volumen 21, Número de artículo: 56 (2023) Citar este artículo

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El trasplante mitocondrial (MTx) es una tecnología emergente pero poco conocida con el potencial de mitigar las lesiones graves por isquemia-reperfusión después de un paro cardíaco (CA). Para abordar las brechas críticas en el conocimiento actual, probamos la hipótesis de que MTx puede mejorar los resultados después de la reanimación CA.

Este estudio consta de estudios in vitro e in vivo. Inicialmente examinamos la migración de mitocondrias exógenas en cultivos de células neurales primarias in vitro. Las mitocondrias exógenas extraídas del cerebro y los tejidos musculares de las ratas donantes y las mitocondrias endógenas de las células neurales se etiquetaron por separado antes del cocultivo. Después de un período de 24 h después del cocultivo, se observó la transferencia mitocondrial mediante microscopía. Se evaluaron los contenidos de trifosfato de adenosina (ATP) in vitro entre mitocondrias recién aisladas y congeladas-descongeladas para comparar sus efectos sobre la supervivencia. Nuestro estudio principal fue un modelo de AC en ratas in vivo en el que las ratas se sometieron a 10 min de AC asfixiante seguido de reanimación. En el momento de lograr una reanimación exitosa, las ratas se asignaron aleatoriamente a uno de tres grupos de inyecciones intravenosas: vehículo, mitocondrias viables congeladas-descongeladas o frescas. Durante las 72 h posteriores a la CA, la eficacia terapéutica de MTx se evaluó mediante la comparación de las tasas de supervivencia. La persistencia de las mitocondrias marcadas del donante dentro de los órganos críticos de los animales receptores 24 h después de la CA se visualizó mediante microscopía.

Las mitocondrias donadas se incorporaron con éxito en células neurales cultivadas. Las mitocondrias exógenas transferidas co-localizadas con las mitocondrias endógenas dentro de las células neurales. El contenido de ATP en las mitocondrias frescas fue aproximadamente cuatro veces mayor que en las mitocondrias congeladas y descongeladas. En el estudio de supervivencia in vivo, las mitocondrias funcionales recién aisladas, pero no las mitocondrias congeladas-descongeladas, aumentaron significativamente la supervivencia a las 72 h del 55 al 91 % (p = 0,048 frente al vehículo). Los efectos beneficiosos sobre la supervivencia se asociaron con mejoras en la recuperación rápida de los niveles de lactato y glucosa arterial, la microcirculación cerebral, el edema pulmonar y la función neurológica. Se observaron mitocondrias marcadas dentro de los órganos vitales de las ratas supervivientes 24 h después de la CA.

MTx realizado inmediatamente después de la reanimación mejoró la supervivencia y la recuperación neurológica en ratas post-CA. Estos resultados proporcionan una base para futuros estudios para promover el desarrollo de MTx como una nueva estrategia terapéutica para salvar vidas perdidas actualmente después de CA.

Informes de revisión por pares

El trasplante mitocondrial (MTx) es una tecnología emergente con el potencial de mejorar la función en células dañadas por isquemia y reperfusión (I/R). Durante un paro cardíaco (CA), la lesión isquémica agota rápidamente el trifosfato de adenosina (ATP) celular, genera radicales libres y desregula el control iónico de sodio y calcio. Estos mecanismos desencadenan cascadas de señalización adicionales que pueden empeorar durante la reperfusión, lo que lleva a una profunda disfunción mitocondrial y muerte [1,2,3,4]. Afortunadamente, las mitocondrias lesionadas son capaces de autorrepararse y protegerse celularmente a través de la fisión, la fusión, la mitofagia y el mecanismo recientemente descrito de transferencia intercelular mitocondrial [5, 6]. El descubrimiento de que las mitocondrias pueden migrar de una célula a otra sugiere la posibilidad de trasplantar mitocondrias sanas de donantes a células con mitocondrias lesionadas [7,8,9].

Varios estudios han identificado mejores resultados después de MTx en los campos de lesión cardíaca [10,11,12,13,14,15,16,17] y accidente cerebrovascular [6, 18]. Las mitocondrias se han inyectado directamente en los tejidos diana o se han administrado mediante infusión intravenosa simple [18]. Sin embargo, se desconoce hasta qué punto las mitocondrias son absorbidas por las neuronas, los miocitos cardíacos y otros órganos. No se sabe cuánto tiempo persisten las mitocondrias donantes en los tejidos como mitocondrias sanas (que respiran) o si simplemente proporcionan partículas mitocondriales biológicamente activas de vida corta. Además, MTx no se ha estudiado en lesiones I/R después de CA.

CA afecta a más de 500.000 personas en los EE. UU. cada año [19]. CA detiene toda la circulación en todo el cuerpo, lo que resulta en una isquemia de todo el cuerpo que es fatal si no se trata. A pesar de los avances en la reanimación y el tratamiento posterior a la parada de los pacientes que padecen AC, la mortalidad supera el 90 % y, de los que sobreviven, muchos presentan déficits neurológicos prolongados y complicaciones cardiovasculares [20,21,22]. En la actualidad, existen pocos fármacos eficaces u otras terapias que puedan mejorar significativamente estos malos resultados [23]. La CA, así como otras emergencias isquémicas, sigue siendo un importante desafío para la salud pública.

Nuestro estudio prueba la hipótesis de que MTx puede mejorar los resultados después de la reanimación de una lesión isquémica grave como una CA. Nos enfocamos en tres preguntas importantes con respecto a MTx: (1) ¿Las mitocondrias alogénicas exógenas, extraídas del cerebro o del músculo, ingresan con éxito a las células neurales en cultivo? (2) ¿La infusión intravenosa de mitocondrias frescas administrada inmediatamente después de la CA cambia las tasas de supervivencia y otros indicadores fisiológicos de lesión por I/R en un modelo animal? (3) ¿Persisten las mitocondrias trasplantadas en los tejidos 24 h después de la CA? Respondemos a estas preguntas a través de una secuencia de estudios experimentales que brindan una base para evaluar más a fondo el papel de MTx en la mitigación de la lesión de múltiples órganos y la mortalidad después de la reanimación de CA.

Para determinar si las mitocondrias de donantes exógenos pueden incorporarse a las neuronas que crecen en cultivo, co-cultivamos mitocondrias exógenas extraídas del cerebro o tejidos musculares de ratas donantes con cultivos de células neurales. Tanto las mitocondrias del donante como los cultivos de células neurales del receptor se derivaron de ratas macho Sprague-Dawley (12 semanas de edad; Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EE. UU.). Las células neurales se aislaron utilizando el kit Adult Brain Disociation (Miltenyi Biotec, Inc., Somerville, MA, EE. UU.). Las células se sembraron a una densidad de 1 × 105 células/cm2 en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-d-lisina (0,1 mg/ml). Las mitocondrias endógenas (nativas) de las células se marcaron por separado 24 h antes de la transferencia mitocondrial con colorante MitoTracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se suspendieron en una solución de tinción precalentada (37 °C) que contenía la sonda MitoTracker Green (300 nM) y se incubaron durante 30 min en un medio estándar en condiciones de crecimiento apropiadas. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en un medio fresco.

Para visualizar la transferencia mitocondrial, las células neuronales en las que las mitocondrias endógenas se tiñeron de verde (ver arriba) se cocultivaron con mitocondrias exógenas donadas (rojas) en un medio de cultivo estándar durante 24 h, y las células se observaron utilizando un sistema de imagen confocal LSM 880 ( Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Alemania).

Para los experimentos de MTx en el cultivo celular, los tejidos cerebrales en tampón de aislamiento mitocondrial [210 mM d-manitol, 70 mM sacarosa, 5 mM HEPES, 1 mM EGTA y 0,5 % (p/v) de albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos (BSA ), pH ajustado a 7,2 con KOH] se rompieron mediante 30 golpes a 500 rpm en un homogeneizador, después de lo cual el homogeneizado se centrifugó a 800 g durante 10 min a 4 °C en un rotor basculante. Luego, el sobrenadante se centrifugó a 12 000 g durante 10 min a 4 °C para crear un sedimento que contenía las mitocondrias. Después de retirar el sobrenadante, el sedimento se lavó dos veces con tampón de aislamiento mitocondrial y el sedimento se resuspendió en una solución de tinción precalentada (37 °C) con PBS que contenía la sonda MitoTracker Deep Red (300 nM) y se incubó durante 30 min. Después de eliminar la solución de tinción, las mitocondrias marcadas se lavaron dos veces con PBS. Las mitocondrias se cuantificaron determinando la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) y se mantuvieron en hielo hasta el trasplante. Las mitocondrias (0,01 mg/mL, concentración final) resuspendidas en 500 μL de medio fresco precalentado se usaron inmediatamente para la transferencia mitocondrial.

Se usaron mitocondrias derivadas de músculos de ratas tanto para experimentos de MTx (A) en cultivo celular como (B) como mitocondrias de donantes usadas por infusión en una rata in vivo como se describe a continuación en nuestro protocolo de modelo de CA. Las mitocondrias se aislaron de una pieza de 6 mm de tejido muscular pectoral mayor sano de una rata usando un método rápido de aislamiento mitocondrial, como se describió previamente [24]. Este método que utiliza un homogeneizador automático y diferentes filtraciones desarrollado para uso clínico cuando la velocidad era esencial, ya que el procedimiento completo puede completarse en 30 minutos, fue informado recientemente por McCully et al. [8, 10, 24]. Brevemente, inmediatamente después de obtener el músculo utilizando un punzón de biopsia de 6 mm, el tejido se picó en tampón homogeneizado frío [sacarosa 300 mM, K-HEPES 10 mM y K-EGTA 1 mM (pH 7.2)] a 4 °C y homogeneizado utilizando un homogeneizador automatizado (disociador GentleMACS; Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Luego, el homogeneizado se sometió a digestión durante 10 min con subtilisina A en hielo (proteasa de Bacillus licheniformis; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. serie de filtros de malla estériles desechables. El filtrado se centrifugó a 9000 g durante 10 min a 4 °C y el sedimento final se resuspendió en 0,5 ml de un tampón de respiración frío [sacarosa 250 mM, KH2PO4 2 mM, MgCl2 10 mM, K-HEPES 20 mM (pH 7,2 ), K-EGTA 0,5 mM (pH 8,0)]. Se informó que el rendimiento de partículas mitocondriales obtenidas utilizando una muestra de tejido de biopsia de 6 mm fue de aproximadamente 1 × 1010 mitocondrias, lo que proporcionó suficientes mitocondrias para la infusión, así como la evaluación de control y garantía de calidad [8, 10, 24]. Estudios previos han demostrado consistentemente la viabilidad y funcionalidad de las mitocondrias aisladas del músculo esquelético usando este método [10, 16, 24, 25]. Las mitocondrias aisladas se usaron inmediatamente para la infusión intravenosa como mitocondrias frescas de donantes o se congelaron y almacenaron a -80 °C durante más de 2 semanas hasta su uso posterior como mitocondrias congeladas y descongeladas.

Los contenidos de ATP se determinaron en (a) tampón de respiración como control negativo, (b) mitocondrias congeladas-descongeladas y (c) recién aisladas usando un kit de ensayo luminiscente (ATPlite, PerkinElmer, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió un total de 10 µl de partículas mitocondriales de las muestras preparadas o tampón de respiración a cada pocillo de una placa blanca de 96 pocillos con fondo opaco. Después de medir la luminiscencia, se calculó la concentración de ATP en cada pocillo utilizando la curva estándar obtenida de la solución madre estándar de ATP.

El potencial de la membrana mitocondrial (ΔψM) se evaluó con el kit de ensayo MitoProbe™ JC1 (5′,6,6′-tetracloro-1,1′,3,3′-tetraetilbencimidazolilcarbocianina) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) usando un Citómetro de flujo BD FAC Symphony (BD Biosciences, San José, CA). JC1 exhibe una acumulación dependiente del potencial (agregados J) en las mitocondrias, indicada por un cambio de emisión de fluorescencia de verde (~ 529 nm) a rojo (~ 590 nm). Por lo tanto, ΔψM puede evaluarse mediante un aumento en los agregados J de fluorescencia roja. Después del aislamiento, la suspensión mitocondrial en 1 mL de tampón de respiración se mezcló con 10 μL de JC1 200 μM (concentración final de 2 μM) con o sin 1 μL de cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona 50 mM (CCCP, concentración final de 50 μM). CCCP es un disruptor potencial de membrana mitocondrial bien establecido. Después de la incubación a 37 °C durante 30 min, la suspensión se centrifugó a 9000 g durante 10 min a 4 °C. Los sedimentos se lavaron una vez añadiendo 1 ml de PBS y se centrifugaron. Los sedimentos se resuspendieron en 500 µl de tampón de respiración fresco. Se usaron muestras sin teñir o perlas de referencia de tamaño (Spherotech, Inc., Lake Forest, IL) para establecer un ajuste de voltaje y tamaño mitocondrial adecuado. La adquisición de eventos positivos para JC1 Red se realizó en 100 000 eventos. Los porcentajes de los agregados J de fluorescencia JC1 Red se midieron como ΔψM en las mitocondrias recién aisladas, las mitocondrias congeladas y descongeladas y un subgrupo de mitocondrias congeladas y descongeladas que se trató con un disruptor de potencial de membrana CCCP como el control de ΔψM más bajo. Las mitocondrias sin teñir se usaron como control negativo. Los datos se analizaron con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, EE. UU.).

En este estudio in vivo se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho adultas (400-545 g, 12-16 semanas de edad; Charles River Laboratories). Los animales se alojaron en una instalación para roedores bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h con acceso ad libitum a alimento y agua. Las ratas se intubaron con un catéter de plástico de calibre 14 (Surflo; Terumo Medical Corporation, Somerset, NJ, EE. UU.) bajo anestesia con isoflurano al 4 % (Isosthesia; Butler–Schein AHS, Dublin, OH, EE. UU.), ventilación mecánica y cirugía. preparado bajo anestesia (2% de isoflurano). Antes del procedimiento quirúrgico, los sitios quirúrgicos se limpiaron con povidona yodada y luego se cubrieron con una manta quirúrgica esterilizada, autoadhesiva, transparente y tratada con povidona. Todos los procedimientos quirúrgicos se llevaron a cabo con equipo estéril y los realizaron los investigadores que desconocían los grupos experimentales. El dióxido de carbono al final de la espiración se mantuvo en 40 ± 5 mmHg durante el experimento ajustando la frecuencia respiratoria (RR) y el volumen corriente (TV), con estos ajustes ajustados dentro del rango de 40/min a 50/min para la RR y 3,5 a 5,0 mL de TV. Se insertaron microcatéteres (PE-50; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) en la arteria femoral izquierda y la vena femoral izquierda para monitorear la presión arterial e infundir medicamentos y mitocondrias del donante, respectivamente. Se inyectó heparina (300 U) en la vena femoral. La temperatura esofágica se mantuvo a 37,0 ± 0,5 °C usando una almohadilla térmica regulada termostáticamente y una lámpara calefactora durante el experimento. Los datos de monitorización de la presión arterial y del electrocardiograma con sonda de aguja se registraron y analizaron utilizando un sistema de adquisición de datos basado en un ordenador personal.

Todos los estudios en animales se realizaron utilizando protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en nuestra institución y de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Las ratas fueron sometidas a CA y resucitación cardiopulmonar, como se describió previamente [26, 27], con modificaciones menores. Brevemente, antes de la inducción de la asfixia, las ratas fueron ventiladas mecánicamente con una fracción de O2 inspirado (FIO2; 0,3), y la anestesia se mantuvo con isoflurano al 2% durante los procedimientos quirúrgicos. Se indujo asfixia con bromuro de vecuronio intravenoso (2 mg/kg), seguido de apagado del ventilador y suspensión del isoflurano. La AC se definió como una presión arterial media < 20 mmHg. A los 10 min después de la inducción de la asfixia, se reinició la ventilación mecánica a una FIO2 de 1,0 y un solo investigador ciego a los grupos experimentales realizó compresiones torácicas manuales a una velocidad de 300/min. A los 30 s de comenzar las compresiones torácicas, se administró un bolo de epinefrina de 20 μg/kg y se continuaron las compresiones torácicas hasta la reanimación exitosa, que se definió como el retorno del ritmo supraventricular con una presión arterial media > 60 mmHg durante 10 s . Las ratas recibieron ventilación mecánica con una FIO2 de 1,0 durante los primeros 10 min después de la reanimación, después de lo cual la FIO2 se redujo a 0,3, seguida de la desconexión del ventilador mecánico y la extubación a las 2 h después de la CA. Se monitorizaron la presión arterial, los registros electrocardiográficos y la temperatura esofágica durante 2 h. Se obtuvieron muestras de sangre arterial para análisis de gases en sangre y lactato al inicio y 15 y 120 minutos después de la CA. No se administró ningún agente inotrópico adicional. Después de un período de recuperación de 2 h, los animales se retiraron del ventilador, se retiraron todos los catéteres vasculares y tubos traqueales y se suturaron las heridas quirúrgicas. Luego, las ratas se devolvieron a sus jaulas con comida y agua de fácil acceso, y se observaron en una instalación para roedores con una temperatura ambiente controlada de 22 °C. Se inyectó buprenorfina XR (0,2 ml; 0,26 mg) por vía subcutánea una vez para aliviar el dolor debido a las incisiones en todos los animales durante el período de recuperación. El tiempo de supervivencia después de la CA se registró hasta 72 h.

Un investigador ciego evaluó la puntuación de la función neurológica (NFS) a las 24, 48 y 72 horas después de la CA utilizando un sistema de puntuación neurofuncional informado previamente [27]. Con esta puntuación, los animales neurológicamente normales recibirían una puntuación de 500, mientras que las ratas muertas o con muerte cerebral se puntuaban con 0 puntos.

Evaluamos la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) al inicio y 2 h después de la CA mediante ecocardiografía. La ecocardiografía transtorácica de tórax cerrado fue realizada por un solo investigador ciego utilizando una sonda de 12–4 MHz (transductor de matriz de sectores S12-4; Philips, Ámsterdam, Países Bajos), y todas las mediciones se promediaron durante tres ciclos cardíacos.

La relación de peso húmedo a seco de pulmón (W/D) se usó como un índice de formación de edema pulmonar. El lóbulo inferior izquierdo se extrajo a las 72 h post-CA, se pesó inmediatamente después de la extracción (peso húmedo) y nuevamente después de secarse en estufa a 37 °C durante 7 días (peso seco). Lung W/D se calculó como la relación entre el peso húmedo y el peso seco.

Los animales sometidos a CA se aleatorizaron en bloques en uno de los tres grupos de intervenciones que se administraron inmediatamente después de que los animales lograran una reanimación exitosa: (a) infusión del tampón de respiración con 0,49 % de BSA (grupo de vehículos; n = 11), (b) infusión de mitocondrias congeladas y descongeladas no funcionales (grupo de mitocondrias congeladas y descongeladas; n = 11), o (c) infusión de mitocondrias viables frescas (grupo de mitocondrias frescas; n = 11). El proceso de congelación y descongelación conduce a una alteración generalizada de la integridad de la membrana externa mitocondrial y suprime la actividad de la cadena de transporte de electrones a través de la pérdida de citocromo c del espacio intermembrana [28]. Por esa razón, utilizamos mitocondrias congeladas y descongeladas como un grupo de control adicional para mantener cantidades similares de proteína mitocondrial, lípidos, ADN, ARN y otras macromoléculas, como las infundidas en los animales tratados con mitocondrias recién aisladas. Estas mitocondrias congeladas y descongeladas alteradas contienen cantidades similares de moléculas biológicas pero no tienen viabilidad ni competencia respiratoria.

El aislamiento de ARN, la transcripción inversa y el análisis de PCR en tiempo real se realizaron en tejidos de cerebro y bazo recolectados a las 72 h después de la reanimación CA y MTx de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se transcribió de forma inversa con SuperScript IV VILO™ Master Mix con ezDNase Enzyme (Thermo Fisher, EE. UU.). La PCR en tiempo real se realizó utilizando TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher, EE. UU.) en el sistema LightCycler 480 (Roche Diagnostics). Los cebadores utilizados son proteína 1 relacionada con dinamina (Drp1, Rn00586466_m1), proteína de fisión mitocondrial 1 (Fis1, Rn01480911_m1), atrofia óptica-1 (Opa1, Rn00592200_m1), mitofusina-1 (Mfn-1, Rn00594496_m1) y mitofusina-2 (Mfn-2, Rn00500120_m1).

Para medir la actividad de la citocromo c oxidasa (COX) en los tejidos, se obtuvieron el cerebro y el bazo de ratas operadas de forma simulada y ratas supervivientes a las 72 h después de la CA en los grupos vehículo, congelado-descongelado o mito fresco. La actividad de la COX en homogeneizados de tejido se midió usando el kit de oxidasa de citocromo C (Abcam, ab239711) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En un conjunto separado de experimentos destinados a determinar los impactos de MTx en la perfusión cerebral durante la fase aguda posterior a la CA, monitoreamos el flujo sanguíneo cerebral relativo (rCBF) durante las primeras 2 h después de la CA. Las imágenes de moteado láser del cerebro se realizaron utilizando el sistema RFLS III de generador de imágenes de perfusión láser de campo completo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RWD Life Science Co., Ltd., Guangdong, China), como se describió anteriormente [29]. Se realizó una incisión en el cuero cabelludo en la línea media para exponer el cráneo para obtener imágenes. El cráneo sobre la superficie cortical izquierda se adelgazó usando un taladro dental, asegurando que la duramadre permaneciera intacta. La cámara se colocó directamente sobre la superficie del cráneo adelgazado. La adquisición continua de imágenes (constante de tiempo, 1 s; tiempo de exposición de la cámara, 5 ms; intensidad del láser, 100 mA; resolución, 2048 × 2048) comenzó en la línea de base previa a la CA y continuó hasta 2 h después de la CA. Los vasos se reconocieron de acuerdo con las características anatómicas y luego se seleccionaron tres regiones de interés (ROI) en la línea de base previa a la CA. Los ROI incluyeron el área sobre la vena cerebral superior izquierda y dos áreas capilares de la superficie cortical izquierda entre las venas cerebrales superiores. Las intensidades de la señal de perfusión se calcularon en cada punto de tiempo utilizando el software del sistema de imágenes de moteado láser y se normalizaron frente a la línea de base [29]. Las medias de los valores de rCBF en los tres ROI se compararon entre los grupos.

En un conjunto separado de experimentos, se usaron ratas sometidas a CA para determinar la captación y persistencia después de 1 y 24 h de mitocondrial marcado en órganos vitales usando un microscopio confocal. Las mitocondrias recién aisladas se marcaron con MitoTracker Deep Red inmediatamente después del aislamiento, y el vehículo o las mitocondrias marcadas se infundieron tras la reanimación de CA. 1 o 24 h después de la CA, los animales fueron sacrificados y el cerebro, corazón, pulmón, riñón, hígado y bazo fueron recolectados y fijados con una solución de paraformaldehído al 4%. Las secciones se montaron con medio de montaje que contenía 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) y se observaron con un sistema de imagen confocal LSM 880 (Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Alemania).

Los datos representan la media ± desviación estándar. Las puntuaciones de la función neurológica se compararon mediante una prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunn. Los datos continuos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con corrección de Šidák para comparaciones post hoc entre múltiples grupos experimentales. Los datos hemodinámicos, cambios de peso corporal, laboratorio y rCBF se examinaron utilizando un modelo de efectos mixtos para análisis de medidas repetidas, seguido de ANOVA con la corrección de Šidák para comparaciones post hoc. Para el estudio de supervivencia in vivo, realizamos un análisis de poder para calcular el tamaño de muestra necesario para lograr una medición confiable del efecto. Como se esperaba que la tasa de supervivencia media a los 3 días después de la AC fuera del 40 % en el grupo del vehículo y del 85 % en el grupo de mitocondrias recién aisladas, anticipamos que se necesitarían 11 ratas por grupo en cada estudio de supervivencia (α = 0,05, β = 0,2 [potencia = 80%], dos caras). Todos los datos están incluidos (no se excluyeron del estudio valores atípicos ni animales). Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier utilizando la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para calcular las tasas de supervivencia entre los grupos. AP < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. GraphPad Prism (v.9.2.0; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.) se utilizó para todos los análisis estadísticos.

Después del aislamiento del tejido, las mitocondrias del donante exógeno se tiñeron con MitoTracker Deep Red y luego se cocultivaron con células neurales, cuyas mitocondrias endógenas se tiñeron con MitoTracker Green. Las mitocondrias cerebrales exógenas se incorporaron a las células neurales mediante un cocultivo simple durante 24 h (Fig. 1A). Las mitocondrias exógenas transferidas (rojas) co-localizadas con las mitocondrias endógenas (verdes) de las células neurales, lo que indica el movimiento de las mitocondrias exógenas dentro de las células, como lo demuestra la tinción amarilla fusionada. Además, observamos la transferencia mitocondrial derivada del músculo exógeno a las células neurales (Fig. 1B). Estos resultados sugieren que las mitocondrias exógenas derivadas del cerebro y los músculos pueden transferirse eficientemente a las células neurales.

Transferencia de mitocondrias exógenas derivadas de cerebro y músculo a cultivos de células neurales. Imágenes representativas de mitocondrias exógenas teñidas con MitoTracker Deep Red y cocultivadas con células cerebrales, cuyas mitocondrias endógenas se tiñeron con MitoTracker Green. Las mitocondrias exógenas (rojas) se extrajeron A del cerebro o B del músculo pectoral de la rata donante. La barra de escala indica 20 µm

Nuestro hallazgo más significativo fue un aumento dramático en la supervivencia neurológicamente intacta cuando las ratas post-CA fueron tratadas con mitocondrias recién aisladas infundidas en comparación con las dos condiciones de control. Los tres grupos de 11 animales cada uno constaban de lo siguiente: (1) un tratamiento con vehículo simple como control negativo (tampón de respiración con BSA al 0,49 %), (2) un control negativo adicional de mitocondrias no funcionales congeladas y descongeladas y (3) nuestro grupo de intervención MTx que recibió mitocondrias de donantes recién aisladas. La Figura 2A ilustra que las mitocondrias recién aisladas son funcionales en comparación con las mitocondrias congeladas y descongeladas. Como era de esperar, el contenido de ATP en las mitocondrias recién aisladas fue aproximadamente cuatro veces mayor que en las mitocondrias congeladas y descongeladas. Los análisis de citometría de flujo confirmaron que el ΔψM fue notablemente mayor en el grupo de mito fresco en comparación con el grupo de mito congelado y descongelado (65,60 ± 18,50, 19,06 ± 6,28, P = 0,047). CCCP no alteró el ΔψM en el grupo de mitos congelados y descongelados (Fig. 2B). Estas observaciones sugieren que las mitocondrias recién aisladas tienen un ΔψM notablemente más alto que las mitocondrias congeladas y descongeladas y que el proceso de congelación y descongelación puede ser suficiente para interrumpir el potencial de membrana.

Las mitocondrias recién aisladas son más funcionales que las mitocondrias congeladas y descongeladas. Un contenido de ATP mitocondrial en el vehículo, mitocondrias congeladas y descongeladas y mitocondrias frescas inmediatamente después del aislamiento mitocondrial. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la corrección de Šidák para las comparaciones post hoc. n = 3–4 por grupo. B El análisis de citometría de flujo del potencial de la membrana mitocondrial de las mitocondrias aisladas teñidas con JC-1 verificó que el porcentaje de agregados J era notablemente mayor en el grupo de mitocondrias frescas que en el grupo de mitocondrias congeladas y descongeladas. El cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP) no alteró el ΔψM en el grupo mitocongelado-descongelado. Se utilizó el ANOVA de una vía con corrección de Šidák para comparaciones post hoc. n = 4 por grupo

En un modelo de AC en ratas in vivo, no se observaron diferencias en las características basales y los parámetros hemodinámicos perioperatorios entre los grupos de vehículo, congelado-descongelado y mito fresco (Tabla 1). Las tasas de supervivencia a las 72 h tanto en el grupo del vehículo como en el del mito congelado-descongelado fueron del 54,5 % (6 de 11 ratas para ambos grupos). Por el contrario, los animales que recibieron inyecciones intravenosas de mitocondrias frescas demostraron tasas de supervivencia de 72 horas significativamente mejoradas del 90,9 % (10 de 11 ratas; P = 0,048 frente a vehículo; P = 0,038 frente a mitocondrias congeladas-descongeladas) (Fig. 3A) . Además, condicionado a la supervivencia, el NFS fue significativamente mayor en el grupo de mito fresca que en el grupo de vehículo a las 72 h después de la CA (P = 0,047) (Fig. 3B). También evaluamos las medidas de mantenimiento de peso en ratas sobrevivientes 72 h después de la reanimación. Los pesos corporales en el grupo de mito fresco fueron significativamente más altos que los del grupo de mito congelado y descongelado a las 72 h después de la CA (Fig. 3C).

El trasplante mitocondrial con mitocondrias recién aisladas mejora la función neurológica y la supervivencia a las 72 h después de un paro cardíaco y reanimación. A Tasas de supervivencia durante las primeras 72 h tras parada cardiaca (PC) y reanimación. n = 11 por grupo. *P = 0,048 frente al grupo de vehículos; #P = 0,038 frente al grupo congelado-descongelado-mito. Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier mediante la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon. B Puntuaciones funcionales neurológicas (NFS) a las 72 h después de la CA en animales supervivientes en el vehículo, mitocondrias congeladas-descongeladas o grupos de mitocondrias recién aisladas. Una puntuación de 0 indica muerte cerebral o ratas muertas. Los animales muertos fueron excluidos de los análisis. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunn. C Cambios diarios en el peso corporal en animales post-AC tratados con vehículo, mitocondrias congeladas-descongeladas o mitocondrias frescas. Se utilizó un modelo de efectos mixtos para análisis de medidas repetidas, seguido de ANOVA unidireccional con corrección de Šidák para comparaciones post hoc. *P = 0,044 frente a grupo de vehículos. Los datos representan la media ± desviación estándar

La Figura 4A muestra la reducción significativa de los niveles de lactato arterial observados en ratas post-CA dentro de los 15 minutos posteriores a la reanimación en el grupo de mito fresco en comparación con los niveles de lactato más altos observados en los grupos de vehículo y congelado-descongelado. También evaluamos el edema pulmonar a las 72 h después de la reanimación midiendo el contenido de agua del pulmón, que fue notablemente más bajo en el grupo de mito fresco (W/D, 4,23 ± 0,85) en relación con el del vehículo (5,70 ± 0,75, P = 0,027) y congelado-descongelado (6,21 ± 1,40, P = 0,003) (Fig. 4B). La ecocardiografía confirmó la ausencia de diferencias significativas en los parámetros hemodinámicos precoces. Como se esperaba, la CA resultó en una FEVI reducida a las 2 h después de la reanimación en todos los grupos (Fig. 4C). Sin embargo, no pudimos identificar diferencias significativas entre los grupos MTx y control para los parámetros hemodinámicos de presión arterial, frecuencia cardíaca y fracción de eyección del ventrículo izquierdo durante las primeras 2 h de monitoreo después de la reanimación (Fig. 4C, D). El monitoreo se interrumpió después de este punto de tiempo; por lo tanto, no se pudo observar ningún cambio posible más allá de este punto. Además, observamos un pH arterial más alto a los 15 minutos y una presión parcial arterial más baja de dióxido de carbono en el grupo de mito fresco en comparación con los grupos de vehículo y congelado-descongelado. Los niveles de glucosa, que suelen ser bastante elevados en los animales inmediatamente después de la CA, fueron más bajos después de 15 min en los animales sometidos a MTx en comparación con los otros grupos. En particular, todos estos niveles volvieron a la línea de base a los 120 min (Fig. 5). Los grupos no diferían en términos de presión parcial de oxígeno, saturación de oxígeno, exceso de base, hematocrito o niveles de electrolitos en sangre (Archivo adicional 1: Fig. S1).

El trasplante mitocondrial mejora la normalización temprana del lactato y mitiga la lesión pulmonar después de un paro cardíaco y reanimación. A Niveles de lactato arterial al inicio antes del paro y 15 y 120 minutos después de la reanimación. n = 11 por grupo. Se utilizó un modelo de efectos mixtos para análisis de medidas repetidas, seguido de análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la corrección de Šidák para comparaciones post hoc. B El edema pulmonar inducido por un paro cardíaco a las 72 h después de la reanimación disminuyó al administrar mitocondrias recién aisladas. C Fracción de eyección del ventrículo izquierdo en la línea de base antes del paro y 2 h después de la reanimación en ratas después del paro tratadas con vehículo, mitocondrias congeladas-descongeladas (mito congeladas-descongeladas) o mitocondrias recién aisladas (mito frescas). Se empleó un modelo de efectos mixtos para análisis de medidas repetidas, seguido de ANOVA con corrección de Šidák para comparaciones post hoc. D Cambios en la presión arterial media (PAM). Se utilizó un modelo de efectos mixtos para análisis de medidas repetidas, seguido de ANOVA con corrección de Šidák para comparaciones post hoc. Los datos representan la media ± desviación estándar

El trasplante mitocondrial normaliza los parámetros metabólicos poco tiempo después del paro cardíaco y la reanimación. pH arterial, B presión parcial de dióxido de carbono (PaCO2) y C niveles de glucosa en la línea de base previa a la CA y a los 15 min y 2 h después de la reanimación entre los grupos. *P < 0,05; grupo de mito fresco vs. vehículo, #P < 0,05; grupo de mito fresco vs. grupo de mito congelado y descongelado. n = 11 por grupo. Se utilizó un modelo de efectos mixtos para análisis de medidas repetidas, seguido de ANOVA con corrección de Šidák para comparaciones post hoc. Los datos representan la media ± desviación estándar

Para caracterizar aún más el mecanismo de los efectos beneficiosos de la inyección mitocondrial fresca, medimos los cambios en la expresión génica de los marcadores de fisión mitocondrial (Drp1, Fis1) y fusión mitocondrial (Opa1, Mfn1, Mfn2) en homogeneizados de tejido del cerebro y el bazo de ratas operadas simuladamente o ratas sobrevivientes a las 72 h después de la CA en el grupo de vehículo, congelado-descongelado o mito fresco. Los resultados se muestran en la Fig. 6. En el cerebro, las mitocondrias frescas atenuaron notablemente las expresiones génicas de todas las proteínas de fusión en comparación con las mitocondrias congeladas y descongeladas. MTx con mitocondrias frescas disminuyó notablemente las expresiones génicas de Mfn1 y Mfn2 en comparación con el grupo del vehículo, mientras que las mitocondrias congeladas y descongeladas no afectaron las expresiones génicas de las proteínas de fisión o fusión. Los grupos no diferían en términos de genes de fisión mitocondrial. En el bazo, las mitocondrias frescas atenuaron notablemente la expresión génica de Opa1 en comparación con las mitocondrias congeladas y descongeladas. Además, la expresión del gen Drp1 en el bazo fue notablemente mayor en el grupo de mito fresco que en el grupo de vehículo.

Cambios en la expresión génica en el cerebro y el bazo en ratas sobrevivientes a las 72 h después de un paro cardíaco y reanimación con o sin trasplante mitocondrial. Expresión génica de moléculas relacionadas con proteínas de fisión mitocondrial (dynamin-related protein 1 [Drp1], proteína de fisión mitocondrial 1 [Fis1]) en cerebro A y B bazo y proteínas de fusión mitocondrial (atrofia óptica-1 [Opa1], Mitofusin-1 [Mfn-1], Mitofusin-2 [Mfn-2]) en el cerebro C y el bazo D. Se utilizó ANOVA con corrección de Sidak para comparaciones post hoc. n = 6, 6 y 10 para los grupos vehículo, mito congelado y descongelado y mito fresco, respectivamente. Los datos representan la media ± desviación estándar

También medimos la actividad de la COX en homogeneizados de tejido del cerebro y el bazo de ratas operadas de forma simulada o ratas supervivientes a las 72 h después de la CA en el grupo de vehículo, congelado-descongelado o mito fresco. Los resultados se muestran en el archivo adicional 1: Fig. S2. El ensayo enzimático colorimétrico mostró que los grupos no diferían en términos de actividad COX tanto en el cerebro como en el bazo. La actividad de la COX en el grupo del vehículo no tuvo cambios en comparación con los del grupo de operación simulada, lo que sugiere la recuperación de la actividad de la COX en homogeneizados de tejido 72 h después de la reanimación con CA en los animales supervivientes.

Para identificar aún más el efecto de MTx en la función neurológica, realizamos una serie separada de estudios en animales, midiendo el impacto de MTx en el flujo sanguíneo cerebral durante 2 horas después de la CA. Medimos rCBF, donde relativo se refiere a la línea de base, en tres ROI en la superficie cortical del cerebro. Utilizamos un sistema de imágenes de moteado láser, comparando el rCBF medido minuto a minuto durante la CA hasta las 2 h posteriores a la CA. La Figura 7A muestra imágenes representativas de los tres ROI de animales en cada uno de los tres grupos en la línea de base y 2 h después de CA. La Figura 7B compara la recuperación de la perfusión cerebral en los tres grupos (n = 6 en cada grupo). Las ratas post-CA que recibieron MTx mejoraron el rCBF a las 2 h en comparación con cualquier grupo de control: 107,7 % ± 5,6 % en el grupo de mito fresca en comparación con 77,5 % ± 4,5 % en el grupo de vehículo (P < 0,0001) y 81,3 % ± 15,9% en el grupo congelado-descongelado-mito (P = 0,024).

El trasplante mitocondrial mejora la perfusión cerebral poco después de un paro cardíaco y reanimación. A Fotografías representativas de imágenes de contraste de moteado láser en la línea de base previa a la CA y 2 h después de la CA en tres grupos. B Cambios en el flujo sanguíneo cerebral relativo medio (rCBF) de ROI en ratas post-AC tratadas con vehículo, mitocondrias congeladas-descongeladas (mito congeladas-descongeladas) o mitocondrias recién aisladas (mito frescas). Se utilizó un modelo de efectos mixtos para análisis de medidas repetidas, seguido de ANOVA con corrección de Šidák para comparaciones post hoc. n = 6 por grupo. Los datos representan la media ± desviación estándar

En una serie adicional de estudios en animales, determinamos la persistencia visual de las mitocondrias de donantes recién aisladas etiquetadas dentro de los órganos y tejidos críticos de los animales receptores de CA mediante microscopía. Las imágenes de fluorescencia confocal de las mitocondrias marcadas con MitoTracker Deep Red confirmaron que 1 y 24 horas después de la inyección después de la CA, se observaron mitocondrias trasplantadas en el cerebro, el riñón y el bazo (Fig. 8). No observamos una persistencia similar de las mitocondrias etiquetadas después de 24 h en el corazón, el hígado o los pulmones (Archivo adicional 1: Fig. S3).

Las imágenes de fluorescencia confocal revelan la persistencia de las mitocondrias del donante dentro de los órganos 1 y 24 h después del paro cardíaco y la reanimación. Se observaron mitocondrias trasplantadas (rojas) en el cerebro, riñón y bazo 1 y 24 h después del paro cardíaco. Las puntas de flecha indican las partículas mitocondriales donadas marcadas con el colorante MitoTracker Deep Red antes de la inyección. Los núcleos celulares se contrastaron con DAPI (azul). La barra de escala indica 20 µm

En este artículo, informamos sobre el potencial de MTx para mitigar el daño causado por la lesión isquémica grave observada en CA. Encontramos que MTx aumentó dramáticamente la supervivencia neurológicamente intacta en un modelo de rata donde las ratas fueron resucitadas de 10 minutos de CA asfixiante. Esta supervivencia mejorada se asoció con mejoras en el metabolismo, el flujo sanguíneo cerebral y el edema pulmonar. Nuestros estudios in vitro confirman que los cultivos de células neurales absorben fácilmente mitocondrias de donantes exógenas recién aisladas y que las mitocondrias de donantes son capaces de respirar y producir ATP. Los estudios de seguimiento in vivo determinaron que las mitocondrias de donantes trasplantadas por infusión intravenosa se pueden encontrar en los tejidos 24 h después de la CA.

Nuestro hallazgo principal fue que MTx mejoró la supervivencia del 55 al 91 % después de la CA. No pudimos encontrar estudios previos de MTx en el contexto de la CA; sin embargo, se ha informado que MTx protege en otros modelos de enfermedades animales, como I/R cardíaca [10,11,12,13,14,15,16,17], accidente cerebrovascular [6, 18], I/R hepática [30, 31], riñón I/R [32, 33], pulmón I/R [25], lesión de la médula espinal [34], Parkinson [35, 36] y esquizofrenia [37]. Por ejemplo, en un modelo de accidente cerebrovascular en ratones, las mitocondrias derivadas del tejido placentario se infundieron por vía intravenosa en animales después de una oclusión carotídea focal, y esto dio como resultado una reducción significativa en el tamaño del infarto en 72 h [18]. En el cerebro isquémico, los astrocitos pueden transferir mitocondrias sanas a neuronas dañadas [6]. Otro estudio encontró que el trasplante de mitocondrias derivadas de músculos redujo el estrés oxidativo celular y la apoptosis, disminuyó el volumen del infarto cerebral y revirtió los déficits neurológicos después de un accidente cerebrovascular isquémico en ratas [38].

También verificamos que el proceso de congelación-descongelación reduce notablemente el contenido de ATP y ΔψM en las partículas mitocondriales aisladas. Este hallazgo es importante por dos razones: (1) valida que nuestro uso del procedimiento de aislamiento rápido, informado por McCully et al., resultó en la extracción de mitocondrias donantes generadoras de ATP funcionales, y (2) congelación y descongelación de mitocondrias produjo mitocondrias relativamente no funcionales que se utilizan para la serie posterior como un grupo de control negativo adicional crítico. Cabe destacar que la mayoría de los estudios previos de MTx utilizaron la solución de vehículo simple sola como único grupo de control negativo [10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 25, 33, 35, 36, 37, 39]. Para nuestra investigación de MTx, queríamos confirmar que era la capacidad funcional de las mitocondrias infundidas lo que se requiere para los cambios en el resultado, y no debido a la infusión de otro componente presente en las partículas mitocondriales que no funcionan. Las partículas mitocondriales congeladas y descongeladas no funcionales contienen cantidades similares de membranas mitocondriales, proteínas y otras macromoléculas, y es razonable creer que algunos de estos componentes podrían tener actividad biológica, tal vez actuando como patrones moleculares asociados al daño o moléculas de señalización. El uso de mitocondrias congeladas y descongeladas como control negativo adicional nos permite eliminar un posible factor de confusión importante.

La traducción de nuestros hallazgos a los humanos podría ocurrir rápidamente, especialmente porque ya se han realizado algunos ensayos en humanos que usan MTx, otros están en curso y se anticipan más. MTx ya se ha utilizado en pacientes pediátricos con isquemia miocárdica poscirugía cardíaca [39, 40]. Guariento et al. informaron sobre pacientes pediátricos con cardiopatías congénitas graves en máquinas de circulación extracorpórea a quienes se les inyectó su propia mitocondria. En su estudio, se realizó MTx para acelerar el proceso de destete y se informó cierto grado de éxito [39, 40]. Además, se está realizando un estudio en humanos para investigar la seguridad de la MTx autóloga administrada al cerebro durante la isquemia cerebral. Walker et al. realizó una biopsia del tejido muscular de un paciente para aislar las mitocondrias junto a la cama e infundió las mitocondrias recién aisladas directamente en el cerebro del paciente (NCT04998357). Esperamos que la serie de estudios presentados aquí estimule aún más la investigación en este campo.

En nuestro estudio, demostramos que las mitocondrias exógenas migran en medios de cultivo y se colocalizan con mitocondrias endógenas en cultivos de células neurales a través de un cultivo conjunto simple durante 24 h. La capacidad de las mitocondrias para migrar de una célula a otra es un descubrimiento reciente y actualmente es un fenómeno poco conocido. Nuestros resultados confirman que las mitocondrias se transfieren fácilmente a través de la membrana celular; esto puede ser un evento natural que ocurre con más frecuencia de lo que se creía anteriormente. Varios estudios respaldan nuestros hallazgos in vitro. Andrabi et al. demostró la transferencia de mitocondrias de astrocitos y microglía a neuronas dañadas [41]. Hayakawa et al. descubrió que las mitocondrias liberadas en el espacio extracelular pueden transferirse de una célula a otra en el cerebro después de un accidente cerebrovascular. Estos hallazgos sugieren un nuevo mecanismo mitocondrial de diafonía neuroglial que puede contribuir a la neuroprotección endógena después de una lesión por I/R cerebral [6, 18]. Spees et al. demostró la transferencia intercelular de mitocondrias normales desde células madre mesenquimales a células de mamíferos que albergan mitocondrias disfuncionales [42]. Por lo tanto, se considera cada vez más que las mitocondrias desempeñan un papel importante en la comunicación y función de célula a célula [41,42,43,44], y la transferencia de mitocondrias de células sanas a células dañadas parece ser un enfoque terapéutico prometedor [6 , 8, 9]. Se necesitan más estudios para determinar los mecanismos precisos por los cuales las células absorben las mitocondrias exógenas durante la I/R y para dilucidar cómo las mitocondrias extracelulares mantienen su viabilidad, migran a los tejidos y actúan para proteger los tejidos durante el proceso de trasplante.

Nuestros resultados de las mediciones de la expresión génica sugieren que la dinámica mitocondrial se desplaza hacia la fisión en el grupo de mitocondrias frescas durante una fase de recuperación en los animales sobrevivientes resucitados de CA, lo que podría estar asociado con los efectos beneficiosos de la suplementación con mitocondrias frescas. Se ha demostrado que la inhibición de la fisión mitocondrial por el inhibidor de Drp1 proporciona efectos beneficiosos contra la lesión cerebral después de la isquemia y reperfusión global [45]. Por el contrario, un estudio anterior demostró que la inhibición de la fisión al inhibir Drp1 o siRNA contribuyó a aumentar la lesión mediada por mitocondrias dañadas, como la generación de ROS, la liberación de citocromo c y la activación de caspasa-3 después de una lesión isquémica-hipóxica, lo que agrava el daño cerebral isquémico. [46]. Se ha demostrado que la fisión mitocondrial permite que las mitocondrias segreguen mitocondrias disfuncionales que contienen proteínas dañadas, ADN mutado o membranas desestabilizadas [47]. Estos resultados contradictorios sugieren que el equilibrio entre la fisión y la fusión y su papel en la recuperación del cerebro aún no se han dilucidado. Además, el papel de la dinámica mitocondrial permanece incompletamente investigado no solo para la fase aguda sino también para la fase de recuperación tardía de la lesión por isquemia-reperfusión. Se justifican más investigaciones para dilucidar el papel de MTx en la dinámica mitocondrial y la lesión cerebral después de la reanimación con CA.

Un hallazgo importante en nuestro estudio es la persistencia de mitocondrias marcadas con fluorescencia en tejidos críticos de animales a las 24 h después de CA. Hasta la fecha, existe literatura limitada sobre la ubicación anatómica donde se toman las mitocondrias circulantes del donante después de la infusión intravenosa. Varios estudios previos han investigado la inyección directa de mitocondrias en el músculo cardíaco y la inyección intracoronaria. Esos estudios demostraron la retención de mitocondrias donantes dentro de las áreas isquémicas del corazón pero no en otros órganos [10, 11, 16]. Por el contrario, un estudio realizado por Nakamura et al., utilizando la misma infusión intravenosa que realizamos, demostró que además de encontrar mitocondrias en las regiones cerebrales isquémicas después de un accidente cerebrovascular, también se identificaron mitocondrias infundidas en varios órganos periféricos, incluidos los pulmones, el hígado, riñón y corazón [18]. Un estudio reciente de Shi et al. demostraron mejoras funcionales en la enfermedad de Parkinson como resultado de MTx. Su estudio determinó la distribución generalizada de las mitocondrias exógenas infundidas por vía intravenosa en muchos tejidos diferentes, incluidos el cerebro, el hígado, los riñones, los músculos y el corazón, y especuló que la enfermedad de Parkinson puede ser causada en parte por las múltiples secuelas orgánicas de la enfermedad mitocondrial [36]. Si bien identificamos la captación de mitocondrias de donantes exógenos en múltiples órganos a las 24 h después de la CA, el mecanismo de captación celular de las mitocondrias infundidas sigue siendo desconocido. Se ha sugerido que las mitocondrias exógenas podrían ingresar a través de vías de endocitosis celular [48,49,50]. Se justifican más estudios para determinar los mecanismos de absorción transmembrana, definir qué tejidos y células absorben la mayor parte de las mitocondrias infundidas y delinear aún más la línea de tiempo para la persistencia de las mitocondrias trasplantadas dentro de los tejidos objetivo.

Único en nuestro estudio es el uso de mitocondrias congeladas y descongeladas no funcionales como control negativo adicional. Estas mitocondrias congeladas y descongeladas no tenían ninguno de los efectos protectores observados con las mitocondrias recién aisladas. Esto sugiere requisitos para una respiración relativamente saludable y mitocondrias productoras de ATP para un trasplante exitoso. Otros estudios han demostrado que MTx puede mejorar los niveles de ATP [51], proteger los péptidos mitocondriales, prevenir respuestas proinflamatorias excesivas [52] y reducir la activación de la vía de muerte celular [53]. Sin embargo, quedan muchas preguntas importantes.

Los estudios preliminares presentados aquí tienen una serie de limitaciones. Se desconoce el mecanismo preciso por el cual MTx mejoró los resultados de supervivencia. Todavía tenemos que determinar si los niveles de ATP en los tejidos receptores se alteran con MTx. No cuantificamos la cantidad de mitocondrias captadas, ni determinamos si los tejidos que captan las mitocondrias eran los tejidos más responsables de los mejores resultados. Además, nuestra dosis y el momento de MTx pueden no ser óptimos. Nuestro modelo de CA animal es un modelo de 72 h a relativamente corto plazo; por lo tanto, los beneficios (o efectos adversos) a más largo plazo siguen sin conocerse. Muchas de nuestras medidas se tomaron en momentos específicos; por lo tanto, es posible que no hayamos podido detectar cambios significativos que ocurren en otros momentos. Para la traducción a terapias humanas, se requieren estudios adicionales para dilucidar la dosis óptima de mitocondrias donantes, los métodos de aislamiento óptimos y el momento ideal de MTx para tratar lesiones I/R. Además, centramos estos estudios en MTx alogénico; sin embargo, esto puede no ser factible en el entorno clínico agudo. Para el desarrollo de terapias humanas pragmáticas, la posibilidad del xenotrasplante, a diferencia del trasplante alogénico o autólogo, se ha sugerido como una dirección futura viable [11, 54, 55].

Encontramos que MTx realizado inmediatamente después de la reanimación de CA mejoró la supervivencia y la recuperación neurológica en ratas. MTx se asoció con una rápida recuperación de los niveles de lactato, pH y glucosa; mejora de la microcirculación y la perfusión cerebral; y disminución de la lesión pulmonar. Estos resultados proporcionan una base para estudios futuros para mejorar nuestra comprensión básica de la biología mitocondrial y promover el desarrollo de MTx como una estrategia terapéutica novedosa para salvar vidas perdidas actualmente después de CA.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Trasplante mitocondrial

Paro cardiaco

Trifosfato de adenosina

Isquemia y reperfusión

Solución salina tamponada con fosfato

Albúmina de suero bovino

potencial de membrana mitocondrial

Cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona

La frecuencia respiratoria

Volumen corriente

Puntuación de la función neurológica

Fracción de eyección del ventrículo izquierdo

Relación de peso húmedo a seco

Proteína relacionada con la dinamina 1

Proteína de fisión mitocondrial 1

Atrofia óptica-1

mitofusina-1

mitofusina-2

Citocromo c oxidasa

Flujo sanguíneo cerebral relativo

Regiones de interés

4,6-diamidino-2-fenilindol

Análisis de variación

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Este estudio fue apoyado por un fondo del Laboratorio de Fisiología de Cuidados Críticos, Institutos Feinstein para la Investigación Médica, Northwell Health.

Laboratorio de Fisiología de Cuidados Críticos, Institutos Feinstein de Investigación Médica, Northwell Health, Manhasset, NY, EE. UU.

Kei Hayashida, Ryosuke Takegawa, Yusuke Endo, Tai Yin, Rishabh C. Choudhary, Tomoaki Aoki, Mitsuaki Nishikimi, Eriko Nakamura, Muhammad Shoaib, Cyrus Kuschner, Santiago J. Miyara, Junhwan Kim, Koichiro Shinozaki y Lance B. Becker

Centro de Inmunología e Inflamación, Institutos Feinstein de Investigación Médica, Northwell Health, Manhasset, NY, EE. UU.

Atsushi Murao y Ping Wang

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Conceptualización: KH y LBB. Metodología: KH, RT, YE, TY, RCC, TA, MN, AM, EN, MS, CK, SJM, JK, KS, PW y LBB. Investigación: KH, RT, YE, TY, RCC, MN, AM y EN. Visualización: KH. Adquisición de fondos: KH y LBB. Administración del proyecto: LBB. Redacción—borrador original: KH. Revisión y edición: KH y LBB. Los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Kei Hayashida o Lance B. Becker.

No aplica.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Sangre arterial y medidas metabólicas muestreadas antes del paro y a los 15 y 120 minutos después de la reanimación. Figura S2. La actividad de la citocromo c oxidasa (COX) en tejidos homogeneizados del cerebro y el bazo de los animales supervivientes a las 72 h después de la CA en el grupo vehículo, congelado-descongelado o mito fresco. Figura S3. Imágenes de fluorescencia confocal para el corazón, el hígado y los pulmones a las 24 h después de la reanimación con CA en ratas tratadas con vehículo o trasplante mitocondrial fresco.

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Reimpresiones y permisos

Hayashida, K., Takegawa, R., Endo, Y. et al. El trasplante mitocondrial exógeno mejora la supervivencia y los resultados neurológicos después de la reanimación de un paro cardíaco. BMC Med 21, 56 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02759-0

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Recibido: 04 Octubre 2022

Aceptado: 30 de enero de 2023

Publicado: 16 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02759-0

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