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Mar 13, 2023

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Volumen de medicina BMC

BMC Medicine volumen 21, Número de artículo: 90 (2023) Citar este artículo

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La preeclampsia (PE) es una de las principales causas de morbilidad/mortalidad materna y fetal durante el embarazo, y la alfa-2-macroglobulina (A2M) está asociada con la señalización inflamatoria; sin embargo, aún no se comprende el mecanismo fisiopatológico por el cual A2M está involucrado en el desarrollo de PE.

Se recogieron muestras de placenta humana, suero y los datos clínicos correspondientes de los participantes para estudiar el mecanismo fisiopatológico subyacente a la EP. A ratas Sprague-Dawley preñadas se les inyectó por vía intravenosa un vector de adenovirus portador de A2M a través de la vena de la cola el día de gestación (GD) 8,5. Se transfectaron células de músculo liso de arteria umbilical humana (HUASMC), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y células HTR-8/SVneo con vectores de adenovirus que expresan A2M.

En este estudio, demostramos que los niveles de A2M aumentaron significativamente en el suero de pacientes con EP, las arterias espirales uterinas y la vasculatura fetoplacentaria. El modelo de rata con sobreexpresión de A2M imitaba de cerca las características de la PE (es decir, hipertensión en la gestación media o tardía, signos histológicos y ultraestructurales de daño renal, proteinuria y restricción del crecimiento fetal). En comparación con el grupo normal, la sobreexpresión de A2M mejoró significativamente la resistencia vascular de la arteria uterina y perjudicó la remodelación de la arteria espiral uterina tanto en mujeres embarazadas con EP de inicio temprano como en ratas embarazadas. Encontramos que la sobreexpresión de A2M se asoció positivamente con la proliferación de HUASMC y se correlacionó negativamente con la apoptosis celular. Además, los resultados demostraron que la señalización del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFβ1) regulaba los efectos de A2M en la proliferación de células musculares vasculares descritas anteriormente. Mientras tanto, la sobreexpresión de A2M hizo retroceder la vascularización placentaria de rata y redujo la expresión de genes relacionados con la angiogénesis. Además, la sobreexpresión de A2M redujo la migración de HUVEC, el número/longitud de los filopodios y la formación de tubos. Además, la expresión de HIF-1α se relacionó positivamente con A2M, y la secreción de sFLT-1 y PIGF de origen placentario estuvo estrechamente relacionada con la PE durante el embarazo o la sobreexpresión de A2M en ratas.

Nuestros datos mostraron que la sobreexpresión de A2M gestacional puede considerarse un factor que contribuye a la EP, lo que causa una remodelación de la arteria espiral uterina y una vascularización placentaria aberrante.

Informes de revisión por pares

Como trastorno multifactorial, la EP es una condición grave de presión arterial asociada con proteinuria excesiva o disfunción orgánica en mujeres embarazadas después de la semana 20 de embarazo; su mecanismo patológico es poco conocido hasta la fecha [1, 2]. En particular, la EP es el factor dominante que causa morbilidad y mortalidad materna y fetal en todo el mundo [3, 4], y los riesgos posteriores de PE son particularmente graves y ponen en peligro la vida tanto de las madres como de sus bebés [4]. La hipoxia persistente en la placenta es un factor importante en la patogenia de la PE. El estrés oxidativo inducido por hipoxia en la EP puede causar un desequilibrio entre los factores proangiogénicos (como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento placentario [PlGF]) y los factores antiangiogénicos (como la tirosina quinasa 1 similar a fms soluble [sFlt1]) , lo que repercute en la función vascular placentaria [5]. Además, el sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) juega un papel clave en la presión arterial alta de la EP de inicio temprano, es decir, hay una mayor sensibilidad a la angiotensina II circulante (ANG II) [6]. Además, en comparación con los embarazos normales, los niveles séricos y las actividades de la mayoría de los componentes del SRAA en la PE están disminuidos, especialmente los niveles de autoanticuerpos AT1R (AT1R-AA), Ang I, Ang II y Ang-(1-7) [ 7, 8]. Estas moléculas biológicamente activas aumentan la vasoconstricción de las arterias de resistencia en la placenta, lo que lleva a un aumento de la hipoxia en la EP.

La creciente evidencia indica que el desarrollo de PE puede deberse muy probablemente a la remodelación inadecuada de la arteria espiral uterina durante el proceso de remodelación vascular debido a trofoblastos disfuncionales [9]. La remodelación adecuada de la arteria espiral uterina se logra cuando la interrupción de la pared elástica muscular uterina materna facilita la invasión de los trofoblastos extravellosos (EVT), es decir, cuando las células epiteliales y del músculo liso vascular (VSMC) son reemplazadas por EVT infiltrantes [10]. El factor de crecimiento transformante β1 (TGFβ1) derivado de las células asesinas naturales uterinas (uNK) regula la apoptosis y la migración de las células del músculo liso vascular, lo que asegura la remodelación adecuada de la arteria espiral [11]. Si este proceso no procede correctamente, la remodelación inadecuada de la arteria espiral uterina restringe el suministro de sangre a la placenta y, posteriormente, conduce a la hipoxia placentaria, lo que aumentará la posibilidad de que se produzca una EP [12].

Se cree que la angiogénesis placentaria defectuosa está implicada en la patogenia de la PE [13]. Por ejemplo, la supresión de la angiogénesis placentaria con suramina (un inhibidor de VEGF), la proteína plasmática A2 asociada al embarazo (PAPP-A2) o la inducción de estrés oxidativo durante el embarazo podría provocar hipertensión materna, disfunción placentaria y retraso del crecimiento fetal, es decir, el índice de diagnóstico de PE [14,15,16]. Además, la activación de la autofagia por la regulación a la baja de la proteína quinasa Cβ (PKCβ) conduce a una angiogénesis placentaria alterada y, en última instancia, induce síntomas similares a los de la PE en ratones [17]. En conjunto, estos datos sugieren la importancia de la angiogénesis placentaria inadecuada en la patogénesis de la PE.

A2M es un inhibidor de la panproteasa sérica que desempeña un papel en un mecanismo único de "atrapamiento" [18,19,20]. Además, A2M ejerce efectos antiinfecciosos y antiinflamatorios al atrapar e inhibir las proteasas liberadas por los neutrófilos [21]. La A2M se sintetiza principalmente en el hígado y se expresa en el cerebro, el corazón y el tracto reproductivo, y en estos tejidos, la A2M participa en muchas funciones fisiológicas y cambios patológicos [18, 22, 23]. Una variedad de factores angiogenéticos importantes se inactivan al unirse a A2M, como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), VEGF y PlGF [22]. En particular, A2M puede regular coordinadamente la vasculatura uterina durante el embarazo [22], lo que nos llevó a investigar las funciones biológicas de A2M en el contexto de la EP. Nuestra hipótesis es que el aumento de la expresión de A2M podría desempeñar un papel negativo en la remodelación de la arteria espiral uterina y la angiogénesis placentaria durante el embarazo, contribuyendo así al desarrollo de la EP.

Se obtuvieron tejidos placentarios de 53 embarazos sanos y 52 mujeres embarazadas con PE de inicio temprano (diagnosticada antes de las 34 semanas de gestación). Se recogieron muestras de suero de mujeres embarazadas en embarazo temprano (22 embarazos sanos en el grupo normal y 18 pacientes con PE de inicio temprano en el grupo de PE), embarazo medio (23 embarazos sanos y 12 pacientes con PE de inicio temprano), embarazo tardío (35 embarazos saludables y 30 pacientes con PE de inicio temprano), y una semana después del parto (18 embarazos saludables y 21 pacientes con PE de inicio temprano). Estas mujeres embarazadas, incluidos los embarazos saludables y los embarazos con EP de inicio temprano, fueron hospitalizadas en el Departamento de Ginecología y Obstetricia del Overseas Hospital, Universidad de Jinan, China, del 1 de enero de 2018 al 23 de mayo de 2021. El diagnóstico de EP se basó en los criterios emitidos. por la Sociedad Internacional para el Estudio de la Hipertensión en el Embarazo (ISSHP) en 2018 [24]. Los criterios de inclusión y exclusión para la recolección de tejido se enumeran en la Tabla 1.

Las vellosidades placentarias y los tejidos deciduales se recogieron inmediatamente después del parto, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada 2 o 3 veces para eliminar la sangre y se fijaron con nitrógeno líquido o paraformaldehído al 4 % para su posterior estudio. Los tejidos vellosos de la placenta en el primer trimestre del embarazo se obtuvieron de casos de embarazos sin complicaciones y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Además, se recolectó sangre venosa periférica de mujeres embarazadas en el grupo normal y el grupo de PE de inicio temprano en tres momentos de gestación muestreados: 11–13+6 semanas de gestación, 14–27+6 semanas de gestación y la primera día del último ingreso hospitalario (generalmente dentro de una semana antes del parto). La sangre posnatal se recolectó a partir del tercer día después del parto y la sangre del cordón umbilical se recolectó inmediatamente después del parto. La sangre materna y del cordón umbilical se recolectó en tubos de recolección de sangre al vacío con EDTA y se centrifugó (3000 × g, 4 °C, 15 min), y el sobrenadante (es decir, plasma) se extrajo y almacenó a -80 °C para su posterior estudio.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Overseas Hospital, Universidad de Jinan, China (número de aprobación: KY-2021-054) y se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado firmado de todos los participantes del estudio.

Se compraron ratas Sprague-Dawley SPF (6 a 8 semanas de edad, 180 a 200 g de peso) de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (SCXK 2012-0001, Beijing, China). Con base en un informe anterior [25], establecimos un modelo de rata con sobreexpresión de A2M mediante inyección en la vena de la cola como se describió anteriormente [26]. Brevemente, en el día gestacional (GD) 8.5, las ratas (excluyendo las ratas no preñadas) fueron inyectadas con adenovirus que expresan A2M (OBiO Technology Co., Shanghai, China), y los resultados de la secuenciación se muestran en el Archivo adicional 1: Resultado complementario 1. Inyectamos una dosis de adenovirus de aproximadamente 1–2 × 109 pfu por animal, y los adenovirus se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta un volumen total de 400 μl. Las ratas tratadas se sacrificaron en GD19.5 (correspondiente al tercer trimestre) para su posterior estudio. Se evaluaron los siguientes parámetros: presión arterial, flujo sanguíneo y proteinuria. El resultado primario de este estudio será la hipertensión con medición de la presión arterial. Los resultados secundarios constituyen el flujo sanguíneo, la proteinuria y los análisis histológicos para medir la morfología y la función celular de la arteria espiral y el vascular placentario. Para las muestras de ratas, primero se sacrificó a las ratas preñadas para recolectar placentas y fetos. De acuerdo con Resource Equation Approach [27], se estudiaron un total de 20 ratas, las ratas se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 10 en cada grupo): los grupos de control y sobreexpresión de A2M (nota: las ratas utilizadas en este experimento provenía de al menos tres lotes de modelado diferentes). Los números aleatorios se generaron usando la función estándar = RAND() en Microsoft Excel. Cada rata fue sacrificada por dislocación cervical después del experimento. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas ARRIVE. Todos los procesos experimentales relacionados con tratamientos con animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos del Comité de ética para la experimentación con animales de la Universidad de Jinan (número de aprobación: 20210302-46).

Para cada animal, participaron al menos siete investigadores diferentes de la siguiente manera: JW era la única persona que conocía la asignación de grupos según la tabla de aleatorización. PZ administró inyecciones intravenosas en la vena de la cola con la ayuda de JW. Luego, GW realizó el análisis de datos con el apoyo de XC. Finalmente, PZ, GW, RL y XY (que tampoco conocían la asignación de grupos) fueron los responsables de la evaluación de los resultados.

Como se describió anteriormente [28, 29], la presión arterial de ratas preñadas conscientes se midió utilizando un sistema de manguito de cola computarizado automatizado después de cinco períodos de entrenamiento consecutivos (Visitech BP2000, Visitech Systems, Inc., EE. UU.). El flujo sanguíneo de la arteria uterina de rata se midió utilizando un dispositivo de ultrasonido de alta resolución (Esaote MyLab30 Gold, Esaote, Génova, Italia) para obtener imágenes bidimensionales. Se recogieron muestras de orina de veinticuatro horas en GD7.5 y GD19.5 para el análisis de proteínas en orina.

La tinción con hematoxilina y eosina (HE) y ácido peryódico de Schiff (PAS) se realizó como sigue. Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4% y posteriormente se incluyeron en parafina. Luego, se procesaron secciones transversales de 4 μm de espesor y se tiñeron con HE o PAS para el análisis morfológico.

La tinción inmunohistoquímica e inmunofluorescente se realizó como sigue. El tejido humano o de rata se fijó en paraformaldehído al 4 %, se deshidrató, se incrustó en cera de parafina y se seccionó en serie con un espesor de 4 μm. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Posteriormente, las secciones se tiñeron con anticuerpos secundarios fluorescentes. Los núcleos se tiñeron con DAPI (Invitrogen). Se tomaron imágenes de las secciones utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus BX53, Tokio, Japón). Se analizaron un mínimo de 5 imágenes aleatorias de 3 muestras por grupo. El análisis estadístico inmunohistoquímico se realizó con el método de puntuación integral de Fromowitz [30]. Los detalles de los anticuerpos se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla complementaria 1.

Proteínas de tejidos humanos y de rata, HUASMC, células HTR-8/SVneo y HUVEC en experimentos de transferencia de Western se analizaron con al menos tres réplicas como se describió anteriormente [31]. Los detalles de los anticuerpos se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla complementaria 2.

Se recogieron muestras de sangre completa de sangre materna o de cordón umbilical humano y de rata. Las sustancias a ensayar en los sueros se midieron por espectrofotometría UV utilizando kits de detección según las instrucciones del fabricante (Mbbiology Biological, Jiangsu, China). Los detalles del kit se proporcionan en Archivo adicional 1: Tabla complementaria 3.

Las biopsias de riñones de rata (1 mm3) se fijaron durante 2 a 4 horas a 4 °C, se lavaron y se almacenaron durante la noche a 37 °C. A continuación, las muestras fijadas se prepararon para cortes ultrafinos. Después de la doble tinción con uranio-plomo, las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante la noche y las imágenes se recolectaron y analizaron bajo un microscopio electrónico de transmisión (HT7700, Hitachi, Japón).

Se usó un kit de apoptosis de Anexina V-FITC (88-8005-72, Thermo Fisher, EE. UU.) para determinar las tasas de apoptosis de células HUASMC y HTR-8/SVneo mediante análisis de citometría de flujo. Las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACS (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE. UU.). Los datos adquiridos se analizaron utilizando el software FCS-Express versión 3.0 (De Novo).

El análisis del ciclo celular también se realizó por citometría de flujo. Brevemente, las células se recogieron y lavaron en PBS, seguido de fijación en etanol (70%). Después de la incubación durante la noche a -20 °C, las células se tiñeron con PI y se sometieron a citometría de flujo. Luego, se determinó la distribución de células en las fases G1, S y G2/M del ciclo celular.

Un total de 5 × 105 células HTR-8/SVneo o HUVEC administrados con vehículo o vectores de adenovirus que expresan A2M durante 48 h se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta alcanzar monocapas confluentes. Luego, se usó una punta de pipeta de 2 μl para crear los rasguños. Las imágenes de las células migradas se registraron a las 0-36 h. Se analizó el porcentaje de cierre de la herida.

Las células transfectadas (1 × 105 células HTR-8/SVneo o HUVEC en 100 μl de medio sin suero) se sembraron en insertos transwell (poros de 8 μm; #3422, Costar, Cambridge, MA, EE. UU.), y el resto de las El protocolo se describió previamente [32] (nota: las células se privaron de suero durante 24 h antes de ser recolectadas de las placas).

Las HUVEC (5 × 104) se sembraron en pocillos recubiertos con Matrigel de placas de 24 pocillos y se incubaron durante 6 h. Los tubos HUVEC se evaluaron bajo un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon TE300, Japón). Se analizó la longitud de los tubos formados. Los experimentos se realizaron por triplicado.

En todos nuestros estudios experimentales, cada experimento se realizó al menos por triplicado y se implementó una evaluación de resultados ciega. Se calcularon los coeficientes medios de variación (CV) para valores por triplicado y luego se determinó un gran CV medio basado en estos valores. El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico SPSS 23.0. La construcción de gráficos estadísticos se realizó utilizando el paquete de software GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, CA, EE. UU.). Se utilizaron pruebas T para analizar las variables continuas distribuidas normalmente, y pruebas U de Mann-Whitney para analizar las variables sesgadas (los datos se distribuyeron normalmente). Todos los valores se presentan como media ± DE o mediana (rango intercuartílico). Las tasas se compararon utilizando las pruebas exacta de Fisher y chi-cuadrado de Pearson, que se emplearon para establecer si había alguna diferencia entre los datos de control y experimentales. P < 0,05 se consideró significativo [31, 33, 34]. Todos los datos estadísticos de experimentos con animales y el valor exacto de n se presentan en el archivo adicional 1: Tabla complementaria 4.

En este estudio, se analizaron estadísticamente los datos de 53 mujeres embarazadas sanas y 52 mujeres embarazadas con EP de inicio temprano para evaluar sus características clínicas y de laboratorio y los resultados adversos del embarazo (Tabla 2). Los resultados son consistentes con las características de la PE (Archivo adicional 1: Resultado Suplementario 2). Usando ELISA y tinción inmunofluorescente, demostramos que los niveles de A2M en suero materno en el segundo y tercer trimestre estaban significativamente elevados en pacientes con EP en comparación con sujetos sanos, pero no hubo una diferencia significativa en el período posnatal (Fig. 1a). La tinción inmunofluorescente de A2M y α-SMA mostró que A2M se expresó predominantemente en los músculos lisos de la arteria espiral en la decidua basal humana (Fig. 1b, d), y hubo una expresión significativamente mayor de α-SMA y A2M en la ONU -arterias espirales remodeladas que en las arterias espirales remodeladas (Fig. 1c). Además, descubrimos las arterias espirales más no remodeladas en PE decidua basalis que en el embarazo normal (Fig. 1d, d1). Además, la doble tinción de inmunofluorescencia de las secciones transversales de las arterias espirales demostró una expresión significativamente mayor de α-SMA y A2M en el grupo de PE en comparación con el grupo normal (Fig. 1d, d2-d3), lo que fue confirmado por datos de transferencia Western de la decidua basal humana (Fig. 1e, e1-e2).

Evaluación de la expresión de A2M en la porción materna y la porción fetal de la placenta. a Determinación de los niveles de A2M en suero materno obtenido del primer, segundo y tercer trimestre del embarazo y el tercer día después del parto en los grupos normal y PE por ELISA. b, c Tinción de inmunofluorescencia representativa de A2M y α-SMA en las secciones transversales de la arteria espiral de la decidua basal del primer trimestre (contrateñida con DAPI) (b), y c es el análisis cuantitativo del área de expresión positiva de α-SMA y A2M en el vaso total. d, d1–d3 Tinción inmunofluorescente representativa de α-SMA y A2M en las secciones transversales de la arteria espiral de la decidua basal del tercer trimestre (contrateñida con DAPI) (d), d1 es el análisis de la proporción de un- vasos sanguíneos remodelados por campo, y d2–d3 es el análisis cuantitativo del área de expresión positiva de α-SMA (d2) y A2M (d3) en el vaso total. e, datos de transferencia Western e1–e2 que muestran la expresión de α-SMA y A2M en la decidua basal del tercer trimestre (e), y e1–e2 son el análisis cuantitativo de la expresión de α-SMA (e1) y A2M ( e2) en los grupos normal y PE. f Determinación de los niveles de A2M en suero de cordón umbilical en los grupos normal y PE por ELISA. g, datos de transferencia Western g1 que muestran el nivel de A2M en el corion velloso del tercer trimestre (g), y g1 es el análisis cuantitativo de la expresión de A2M en los grupos normal y PE. h Análisis inmunohistoquímico A2M de cortes transversales del corion velloso del primer o tercer trimestre. i Tinción inmunohistoquímica representativa de HE y CD31 en cortes transversales de corion velloso del tercer trimestre de los grupos normal y PE. j, j1–j2 Tinción inmunohistoquímica de VEGF y VEGFR2 en cortes transversales del corion velloso del tercer trimestre de los grupos normal y PE (j), y j1–j2 muestran el análisis cuantitativo de VEGF (j1) y VEGFR2 (j2) expresión en los dos grupos. Barras de escala = 100 μm en b y d; 20 μm en h–j. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Usando ELISA y transferencia Western, demostramos que los niveles de A2M en el suero del cordón umbilical y el corion velloso estaban significativamente elevados en pacientes con EP en comparación con sujetos sanos (Fig. 1f, g, g1), y A2M se expresó específicamente en el endotelio vascular de la corion velloso en placenta humana, como lo revela la tinción inmunohistoquímica de A2M (Fig. 1h). Además, se observaron menos vasos sanguíneos y capacitancias vasculares más pequeñas en las placentas de pacientes con EP que en las placentas del grupo normal (Fig. 1i), mientras que descubrimos una expresión significativamente menor de VEGF y su receptor VEGFR2 en el grupo PE (Fig. 1j, j1 –j2).

El establecimiento exitoso del modelo de rata con sobreexpresión de A2M (Fig. 2a) se verificó mediante los datos de ELISA (Fig. 2b) y transferencia Western (Fig. 2c, d). Hubo un aumento significativo de los niveles de A2M en el suero materno y en las ratas con sobreexpresión de A2M en el día 19.5 de gestación (Fig. 2b) y una mayor expresión de la proteína A2M en la decidua basal de ratas con sobreexpresión de A2M (Fig. 2c, c1) y feto-placenta ( Fig. 2d, d1) en comparación con las de las ratas de control (vehículo).

Evaluación de la presión arterial y los índices de función hepática y renal en el modelo de rata con sobreexpresión de A2M. a Ilustración esquemática del establecimiento de un modelo humanizado de rata embarazada con sobreexpresión de A2M. b Determinación de los niveles de A2M en el suero de ratas preñadas durante diferentes etapas de gestación (GD7.5 y GD19.5) en los grupos control y sobreexpresión de A2M por ELISA. c, d, datos de transferencia Western c1–dI que muestran el nivel de A2M en la decidua basal (c) y feto-placenta (d), y c1–d1 son el análisis cuantitativo de la expresión de A2M en ratas de control y sobreexpresión de A2M. e–h Las tendencias en la variación de la presión sistólica (e, g) o diastólica (f, h) de los grupos de control y de sobreexpresión de A2M en ratas no preñadas (e, f) y preñadas (g, h). i, j Imágenes TEM representativas de los riñones de ambos grupos. k–o Tinción HE representativa (k–l) y tinción PAS (m, n) de secciones transversales de riñones de rata de los grupos de control y sobreexpresión de A2M, y o muestra el análisis cuantitativo del área del espacio de Bowman de ambos grupos . p Niveles de proteína en orina (mg/24 h) en GD7.5 y GD19.5 de las ratas control y con sobreexpresión de A2M. q–u Determinación de los niveles de BUN (q), CREA (r), UA (s), ALT (t) y AST (u) en sueros de ratas de los grupos control y sobreexpresión de A2M. Barras de escala = 5 μm en i, j; 50 μm en k-n. Abreviaturas: TEM, microscopio electrónico de transmisión; Enc, célula endotelial; Podo, podocito; tapa, capilar; BUN, nitrógeno ureico en sangre; CREA, creatinina; AU, ácido úrico; ALT, alanina aminotransferasa; AST, aspartato aminotransferasa. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Para evaluar si las manifestaciones del modelo de rata con sobreexpresión de A2M eran consistentes con las manifestaciones clínicas de la EP, primero medimos dinámicamente la presión arterial de las ratas a las que se les administró vehículo o vectores de adenovirus que expresan A2M. Los resultados no mostraron cambios en la presión arterial en ratas no embarazadas después de la administración de A2M (Fig. 2e, f), pero tanto la presión sistólica como la diastólica aumentaron significativamente pero gradualmente en las ratas a las que se les administró A2M dentro de 1 semana de la administración de A2M (Fig. 2g, h). Las imágenes TEM del glomérulo de rata indicaron claramente que la sobreexpresión de A2M causó daño ultraestructural al glomérulo, como edema, lumen vascular colapsado e hiperplasia endotelial (Fig. 2i, j). La tinción con HE y PAS mostró que la sobreexpresión de A2M de hecho causó un aumento en la infiltración de células inflamatorias e incluso daño morfológico en el glomérulo, como una cápsula de Bowman más estrecha, en comparación con el control (Fig. 2k-o). La medida de proteína en orina de 24 h se realizó mediante un ensayo de proteína BCA y los resultados mostraron un aumento significativo en la rata con sobreexpresión de A2M en comparación con las ratas de control en el día 19,5 de gestación (Fig. 2p). Los resultados de ELISA indicaron aumentos significativos en el nivel de BUN y CREA, pero no cambios significativos en los niveles de ALT, AST y UA en el suero de rata administrado con A2M en comparación con el suero de rata de control (Fig. 2q-u). Además, la sobreexpresión materna de A2M condujo a una restricción del crecimiento fetal (p. ej., menos fetos y más pequeños, y tamaño de la placenta) (Archivo adicional 1: Fig. S1).

Debido a que A2M se expresa en gran medida en los músculos lisos vasculares de las mujeres embarazadas con EP de inicio temprano, razonablemente planteamos la hipótesis de que la EP fue causada por una remodelación notablemente defectuosa de la arteria espiral uterina [35], lo que condujo a un aumento de la resistencia vascular placentaria [36] (Fig. 3a). Por lo tanto, evaluamos una serie de índices de resistencia vascular [37] en mujeres embarazadas humanas (Fig. 3b-g). Los resultados mostraron que el IP del cordón umbilical (Fig. 3b) y el RI (Fig. 3c) aumentaron significativamente en el segundo y tercer trimestre del embarazo en mujeres con EP en comparación con mujeres sanas, y hubo aumentos significativos en la pulsatilidad de la arteria uterina izquierda. (Lt ut-PI) (Fig. 3d), el índice de pulsatilidad de la arteria uterina derecha (Rt ut-PI) (Fig. 3e), el índice de resistencia de la arteria uterina izquierda (Lt ut-RI) (Fig. 3f), y el índice de resistencia de la arteria uterina derecha (Rt ut-RI) (Fig. 3g) en las mujeres embarazadas con EP en comparación con las mujeres embarazadas sanas. Además, la evaluación por ultrasonido de ratas preñadas (Fig. 3h) indicó que la sobreexpresión de A2M mejoró significativamente Lt ut-PI (Fig. 3h1) y Lt ut-RI (Fig. 3h2) en comparación con el control. La inmunohistoquímica mostró una expresión mejorada de α-SMA en la arteria espiral y más arterias espirales no remodeladas en ratas con sobreexpresión de A2M (Fig. 3i, i1-i2). Se obtuvieron resultados similares para la expresión de α-SMA mediante transferencia de Western (Fig. 3j).

Evaluación del índice de remodelación de la arteria espiral en mujeres embarazadas y ratas con sobreexpresión de A2M. a Ilustración esquemática del establecimiento de EP debido al fracaso de la remodelación de la arteria espiral. b, c Determinación de los valores de PI (b) y RI (c) de la arteria umbilical en los grupos normal y PE durante el segundo y tercer trimestre del embarazo. d–g Determinación de los niveles de Lt ut-PI (d), Rt ut-PI (e), Lt ut-RI (f) y Rt ut-RI (g) en los grupos normal y PE durante el primero, segundo y tercer trimestre del embarazo. h, h1–h2 Ecografía representativa de la arteria espiral uterina de rata de control y ratas con sobreexpresión de A2M (h), y h1–h2 muestran el análisis cuantitativo de Lt ut-PI (h1) y Lt ut-RI (h2) de lo anterior grupos i, análisis inmunohistoquímico i1-i2 α-SMA de secciones transversales de arterias espirales de los grupos de control y sobreexpresión de A2M (i). i1 es el análisis cuantitativo de la expresión de α-SMA e i2 es la proporción de arterias espirales no remodeladas por campo en los dos grupos. j, datos de transferencia Western j1 que muestran el nivel de α-SMA en la decidua basal (j) y j1 es el análisis cuantitativo de la expresión de α-SMA en los grupos de control y sobreexpresión de A2M. Barras de escala = 100 μm en i. Abreviaturas: PI, índice de pulsatilidad; IR, índice resistivo; Lt ut, arteria uterina izquierda; Rt ut, arteria uterina derecha. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Investigamos el efecto de la expresión de A2M en la proliferación y apoptosis de las células del músculo liso de la arteria espiral uterina mediante la manipulación de la expresión de A2M en HUASMC. El ensayo CCK8 (Fig. 4a) y la transferencia de Western (Fig. 4b, b1-b2) indicaron que la proliferación celular aumentó drásticamente en el grupo de sobreexpresión de A2M y disminuyó en el grupo de regulación negativa de A2M. El análisis de citometría de flujo demostró que la eliminación de la expresión de A2M en HUASMC no afectó la progresión del ciclo celular ni la apoptosis, pero la sobreexpresión de A2M provocó la detención del ciclo celular en la fase S (Fig. 4c-f) y la supresión de la apoptosis celular (Fig. 4g-j) . Los experimentos en muestras humanas reforzaron la observación de la siguiente manera. La tinción de inmunofluorescencia doble de α-SMA y PCNA mostró un mayor número de células positivas para PCNA en la decidua basal de pacientes humanos con EP (Fig. 4k, k1), y se obtuvieron resultados similares para la expresión de PCNA mediante transferencia Western (Fig. 4l) . Además, el análisis de transferencia Western mostró que la expresión de FAS disminuyó en la decidua basal de los pacientes con EP (Fig. 4m).

Evaluación de la proliferación y la apoptosis en células de músculo liso de la arteria umbilical humana (HUASMC) después de la manipulación de la expresión de A2M y la decidua basal humana. a, b, b1–b2 Determinación de la viabilidad de HUASMC en los grupos de control, sobreexpresión de A2M y regulación negativa de A2M después de 12, 24, 48, 72 y 96 h de incubación mediante el ensayo CCK-8 (a). Los datos de transferencia Western que muestran la expresión de A2M y α-SMA en HUASMC (b) y b1–b2 muestran el análisis cuantitativo de la expresión de A2M (b1) y α-SMA (b2) entre el control, la sobreexpresión de A2M y A2M- grupos regulados a la baja. c–f Datos de citometría de flujo que muestran el análisis del contenido de ADN en HUASMC transfectadas con control negativo (control) (c), vector de silenciamiento de A2M (A2Msi) (d) o vector de sobreexpresión de A2M (A2M) (e), y f muestra el análisis cuantitativo de la proporción de células en cada fase del ciclo celular en los tres grupos. g–j La apoptosis de HUASMC transfectadas con control negativo (control) (g), vectores de silenciamiento de A2M (h) o vector de sobreexpresión de A2M (i) se determinó mediante citometría de flujo utilizando el ensayo de apoptosis de anexina V-FITC/PI, y j muestra el análisis cuantitativo de las tasas de apoptosis celular en los tres grupos. k, k1 Tinción de inmunofluorescencia doble representativa de α-SMA y PCNA en las secciones transversales de las arterias espirales (contrateñidas con DAPI) del tercer trimestre de los grupos normal y PE, y k1 muestra el análisis cuantitativo de la expresión de PCNA en ambos grupos . l, m Datos de transferencia Western que muestran la expresión de PCNA (l) y FAS (m) y el análisis cuantitativo de la decidua basal humana del tercer trimestre de los grupos normal y PE. Barras de escala = 50 μm en k. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Para determinar los efectos de los EVT en la remodelación de la arteria espiral uterina [38, 39] en el contexto de la sobreexpresión de A2M, se utilizaron ensayos de cicatrización de heridas e invasión transwell, y los resultados demostraron que la sobreexpresión de A2M suprimió significativamente las capacidades migratorias e invasivas de HTR-8 /Células SVneo (Archivo adicional 1: Fig. S2). También encontramos que la proliferación de células trofoblásticas disminuyó y la apoptosis celular aumentó en el contexto de la sobreexpresión de A2M (Archivo adicional 1: Fig. S3).

La transferencia de Western mostró que la sobreexpresión de A2M mejoró la expresión de PCNA y p-Smad2 / 3, mientras que la regulación negativa de A2M suprimió la expresión de ambos genes en HUASMC (Fig. 5a, a1-a4); además, la adición de TGFβ1 aumentó significativamente la expresión de A2M, PCNA y p-Smad2/3 (Fig. 5b, b1-b4). Los datos de transferencia Western demostraron que la expresión de TGFβ1 estaba elevada en la decidua basal de pacientes con EP en comparación con mujeres embarazadas normales (Fig. 5c).

Evaluación de la proliferación y la señalización de TGFβ en células de músculo liso tras la manipulación de la expresión de A2M y la decidua basal humana. a, a1–a4 Datos de transferencia Western que muestran la expresión de A2M, p-Smad2/3, TGFβ1 y PCNA en HUASMC transfectadas con control negativo, sobreexpresión de A2M o vectores de silenciamiento de A2M (a), y a1–a4 muestra la análisis cuantitativo de A2M (a1), p-Smad2/3 (a2), TGFβ1 (a3) ​​y PCNA (a4) en los grupos de control, sobreexpresión de A2M y regulación negativa de A2M. b, b1–b4 Datos de transferencia Western que muestran la expresión de A2M, p-Smad2/3, TGFβ1 y PCNA en HUASMC transfectadas con control negativo, tratadas con TGFβ1 y A2M silenciadas + tratadas con TGFβ1 (b) y b1–b4 muestran el análisis cuantitativo de las expresiones de A2M (b1), p-Smad2/3 (b2), TGFβ1 (b3) y PCNA (b4) entre el control, el tratamiento con TGFβ1 y los grupos silenciados con A2M + tratados con TGFβ1. c Datos de transferencia Western que muestran la expresión de TGFβ1 y el análisis cuantitativo de la expresión de TGFβ1 en decidua basal humana del tercer trimestre de los grupos normal y PE. d Ilustración esquemática de la sobreexpresión de A2M que conduce a la proliferación celular a través de la vía de señalización de TGFβ. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

La tinción con PAS mostró que las proporciones entre el tamaño del laberinto y el tamaño de la placenta completa eran más pequeñas en las ratas con sobreexpresión de A2M que en las ratas de control (Fig. 6a, a1). La tinción con HE mostró que el área de los sinusoides sanguíneos disminuyó en la capa de laberinto de las ratas con sobreexpresión de A2M en comparación con el control (Fig. 6a, a2). La tinción de inmunofluorescencia reveló la A2M elevada y la expresión reducida de Caveolin1 en el laberinto de las ratas con sobreexpresión de A2M en comparación con las ratas de control (Fig. 6b, b1-b2). Estos hallazgos fueron confirmados por datos de transferencia Western del laberinto de rata (Fig. 6c, d, c1-d1). Además, la transferencia Western mostró que la expresión de VEGF y CD31 en el laberinto placentario con sobreexpresión de A2M fue significativamente mayor que en el control (Fig. 6e, f, e1-f1).

Evaluación de la angiogénesis fetoplacentaria en el modelo de rata con sobreexpresión de A2M. a, a1–a2 Tinción representativa de PAS y HE (a) en las secciones transversales de placenta de rata de los grupos de control y sobreexpresión de A2M, y a1–a2 son el análisis cuantitativo del área de la zona laberíntica placentaria (a1) y el área de la sinusoide de sangre placentaria (a2) de los grupos de control y sobreexpresión de A2M. b, b1–b2 Tinción inmunofluorescente representativa de A2M y Caveolin1 en las secciones transversales de placenta de rata de los grupos de control y sobreexpresión de A2M (b), y b1–b2 son el análisis cuantitativo de áreas positivas de expresión de A2M y Caveolin1 (% ). Datos de transferencia de Western c–f, c1–f1 que muestran la expresión de A2M (c), Caveolin1 (d), VEGF (e) y CD31 (f) en la zona laberíntica placentaria de los grupos control y sobreexpresión de A2M. c1–f1 muestra el análisis cuantitativo de la expresión de A2M (c1), Caveolin1 (d1), VEGF (e1) y CD31 (f1) de los grupos de control y sobreexpresión de A2M. Barras de escala = 2 mm en el panel superior de a; 100 μm en el panel inferior de a; 50 micras en b. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

A continuación, se utilizaron ensayos de cicatrización de heridas y migración transwell para evaluar las capacidades de migración e invasión de las HUVEC. Los resultados mostraron que tanto la tasa de cierre de heridas (Fig. 7a, a1) como la cantidad de HUVEC que migraron al lado inferior de la membrana (Fig. 7b, b1) disminuyeron significativamente en los grupos de sobreexpresión de A2M en comparación con los grupos de control. Los filopodios afectan la migración celular, como se presenta en la Fig. 7c, la tinción con actina F en HUVEC indicó la longitud y el número reducidos de filopodios en HUVEC con sobreexpresión de A2M en comparación con el control (Fig. 1c, c1-c2). Además, la sobreexpresión de A2M en HUVEC disminuyó significativamente la expresión de ZO-1 (Fig. 7d, d1) y suprimió significativamente la formación de tubos HUVEC (Fig. 7e, e1), lo que implica la inhibición de la capacidad de migración de células epiteliales.

Evaluación de la migración celular y la formación de tubos de HUVEC después de la manipulación de la expresión de A2M. a, a1 Imágenes representativas de ensayos de cicatrización de heridas de HUVEC a las 24 h de control negativo (control) o grupos de sobreexpresión de A2M (a), y a1 muestra el análisis cuantitativo de la migración celular relativa en ambos grupos. b, b1 Imágenes representativas de ensayos de migración transwell de HUVEC transfectadas con control negativo o vectores de sobreexpresión de A2M después de 24 h de incubación (b), y b1 muestra el análisis cuantitativo del número de células migradas en ambos grupos. c, c1–c2 Tinción fluorescente representativa e imágenes de gran aumento de actina F en el control negativo o HUVEC con sobreexpresión de A2M (c), y c1–c2 muestran el análisis cuantitativo de los números (c1) y la longitud (c2) de filopodios de cada celda en ambos grupos. d, d1 Tinción inmunofluorescente representativa de ZO-1 en el control negativo o HUVEC con sobreexpresión de A2M (d), y d1 muestra el análisis cuantitativo de la intensidad de fluorescencia relativa de ZO-1 (% de control) en ambos grupos. e, e1 Imágenes representativas de ensayos de formación de tubos de HUVEC después de 6 y 24 h de incubación de grupos de control negativo o sobreexpresión de A2M, y e1 muestra el análisis cuantitativo de la longitud total del tubo (% del control) a las 6 h de incubación en ambos grupos Barras de escala = 200 μm en a y e; 50 μm en b y d; 20 micras en c. **P < 0,01, ***P < 0,001

La transferencia de Western demostró una alta expresión de HIF-1α en HUASMC con sobreexpresión de A2M, pero ningún cambio en la expresión de HIF-1α cuando A2M estaba regulado a la baja (Fig. 8b-b1). Estos resultados sugirieron que la remodelación defectuosa de la arteria espiral, así como la angiogénesis placentaria aberrante, causan isquemia, lo que induce aún más la alta expresión de HIF-1α. En particular, encontramos que el nivel de sFLT-1 fue significativamente más alto y el nivel de PIGF se redujo significativamente en el grupo PE en comparación con el grupo normal durante las diferentes etapas del embarazo (Fig. 8c, d). Hubo una correlación negativa entre PIGF y A2M (R = -0,768, P <0,001) y una correlación positiva entre sFLT-1 y A2M (R = 0,659, P <0,001) en plasma materno de mujeres con preeclampsia (archivo adicional 1: Figura S4). En el modelo de rata con sobreexpresión de A2M, los niveles de sFLT-1 aumentaron (Fig. 8e) y los niveles de PIGF disminuyeron (Fig. 8f), significativamente en los sueros de ratas con sobreexpresión de A2M en comparación con las ratas de control a los 19,5 días de gestación.

Medición de los niveles de HIF-1α y sFIt-1/PIGF en suero materno y HUASMC manipulados con A2M. a Ilustración esquemática de remodelación inapropiada de la arteria espiral y angiogénesis placentaria anormal en presencia de sobreexpresión de A2M. b, datos de transferencia Western b1 que muestran la expresión de HIF-1α en los grupos de control, sobreexpresión de A2M y regulación negativa de A2M (b), y b1 muestra el análisis cuantitativo de la expresión de HIF-1α en los tres grupos. c, d Datos de ELISA que muestran los niveles de sFLT-1 (c) y PIGF (d) en suero materno humano obtenidos del primer, segundo y tercer trimestre del embarazo en los grupos normal y PE. e, f Datos ELISA que muestran los niveles de sFLT-1 (e) y PIGF (f) en suero de rata materna en GD7.5 y GD19.5 en los grupos control y sobreexpresión de A2M. *P < 0,05, ***P < 0,001

Un estudio anterior demostró que la inflamación sistémica leve en realidad se produjo en mujeres embarazadas sanas, y el estado empeoró en la EP [40]. En el presente estudio, informamos que un mayor nivel de A2M estuvo involucrado en la aparición de preeclampsia de inicio temprano a través de su impacto negativo en la remodelación de la arteria espiral uterina y la angiogénesis placentaria (Fig. 9). Debido a que A2M puede reducir la lesión inflamatoria endógena/exógena, se ha utilizado en una variedad de tratamientos de dolores ortopédicos, como la bursitis subacromial, la epicondilitis lateral y la tendinitis de Aquiles [41]. A2M también se utiliza para determinar el estado de inflamación en enfermedades degenerativas, inmunitarias, digestivas y del sistema urinario [42,43,44,45]. En este estudio, encontramos un desequilibrio entre las citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias en el embarazo con PE (Archivo adicional 1: Fig. S5), lo que implica la posibilidad de que A2M esté involucrada en el desarrollo de PE durante el embarazo. Como un inhibidor de proteinasa único, A2M no elimina por completo las citocinas proinflamatorias en la EP, mientras que la A2M elevada puede ser responsable del fenotipo similar a la PE, lo que sugiere que la A2M puede desempeñar un papel de espada de doble filo en el desarrollo de la PE [46]. .

Un modelo propuesto que muestra la suposición subyacente del papel de A2M en el desarrollo de PE. El mecanismo propuesto por el cual A2M está involucrado en la aparición de PE a través de su impacto negativo en la remodelación de la arteria espiral uterina y la angiogénesis placentaria

Tanto la modificación de la arteria espiral uterina como la angiogénesis placentaria son eventos cruciales que proporcionan un suministro de sangre suficiente para perfundir completamente la placenta y así satisfacer las demandas del feto en crecimiento durante el embarazo [47, 48]. Por lo tanto, si las modificaciones se interrumpen por cualquier motivo, la consecuencia sería la modificación inadecuada de las arterias espirales y la angiogénesis placentaria aberrante, lo que podría aumentar mucho el riesgo del escenario de TEP [49]. Por lo tanto, en este estudio, investigamos los posibles efectos de la sobreexpresión de A2M en ambos eventos en el desarrollo de PE durante el embarazo.

Nuestro estudio clínico de cohortes de embarazo mostró que A2M se expresó predominantemente en la arteria espiral desde el tercer trimestre del embarazo, lo que es similar a la expresión de α-SMA; los niveles de A2M en el suero de mujeres embarazadas con EP de inicio temprano aumentaron significativamente en el segundo y tercer trimestre del embarazo, y se observaron resultados similares en la decidua basal uterina humana (Fig. 1a-e), lo que indica la aparición de Remodelación inadecuada de la arteria espiral uterina. En otras palabras, la sobreexpresión de A2M podría estar estrechamente asociada con la fisiopatología de la EP al afectar negativamente la remodelación de la arteria espiral uterina. Especulamos que A2M inhibía las proteasas, las citocinas y los factores de crecimiento relacionados [50], lo que afectaría la supervivencia y las funciones fisiológicas de las células del músculo liso durante la remodelación de la arteria espiral. Además, encontramos que la sobreexpresión de A2M en el lecho vascular placentario restringió drásticamente la angiogénesis placentaria (Fig. 1f-j); por lo tanto, la vascularización anormal de las vellosidades placentarias es obviamente un factor clave que no puede pasarse por alto. Cabe señalar que se informó que A2M participa en la aterosclerosis al facilitar la lipogénesis de las células del músculo liso vascular [51], lo que sugiere un posible mecanismo patológico en la EP, es decir, una lesión vascular similar en el embarazo.

Se estableció la sobreexpresión de A2M en ratas no preñadas y preñadas (Fig. 2) para investigar la posibilidad de la participación de A2M en la EP. Las diferentes respuestas de la presión arterial a la sobreexpresión de A2M entre ratas no embarazadas y embarazadas indicaron en particular que el aumento de la presión arterial inducido por la sobreexpresión de A2M estaba asociado con el embarazo (Fig. 2e-h). Además, se observaron los siguientes fenotipos: cambios morfológicos en los riñones de rata y proteinuria en las ratas que sin duda contribuyeron a la aparición de PE en ratas con sobreexpresión de A2M (Fig. 2i-u) y restricción del crecimiento intrauterino y mala placentación (Archivo adicional 1: Fig. S1) que fueron extremadamente coincidentes con los índices de diagnóstico de EP [52, 53]. Además, la sobreexpresión de A2M también suprimió en gran medida la vascularización placentaria (Fig. 6). Todos estos datos nos llevaron a explorar más a fondo la relación causal entre la sobreexpresión de A2M y la EP.

Con respecto a la remodelación de la arteria espiral uterina [54], encontramos que la sobreexpresión de A2M promovió la proliferación de células HUASMC e inhibió la apoptosis de las células HUASMC (Fig. 4a-j), lo que implica que el reemplazo normal de las células endoteliales espirales uterinas y las células del músculo liso estaba restringido en el contexto de sobreexpresión de A2M. En otras palabras, la sobreexpresión de A2M podría evitar la regulación en cascada de la descomposición normalmente progresiva de las células endoteliales y del músculo liso en las arterias espirales uterinas, lo que aumenta el riesgo de desarrollar PE. Por otro lado, se evaluaron las características de las células trofoblásticas sobreexpresadas por el gen A2M debido a que la migración e invasión de las células trofoblásticas juega un papel muy importante en la remodelación de la arteria espiral uterina [55, 56]. Los resultados experimentales revelaron que tanto las capacidades migratorias como las invasivas, así como la apoptosis y la proliferación de células trofoblásticas, se vieron dramáticamente afectadas por la expresión elevada de A2M (archivo adicional 1: Fig. S2-S3), lo que sugiere que las EVT de origen fetal podrían estar influenciadas por A2M sobrecargado a través de un mecanismo poco claro. Para abordar aún más los fenotipos mencionados anteriormente, evaluamos la señalización de TGFβ después de la manipulación del gen A2M, ya que se sabe que la superfamilia TGFβ regula las respuestas de las células del músculo liso y endotelial vascular durante la remodelación de los vasos en condiciones fisiológicas y patológicas [57]. Como era de esperar, nuestra evidencia experimental (Fig. 5a, b) mostró claramente una relación causal entre la expresión del gen A2M y la activación de la señalización de TGFβ, es decir, la señalización de TGFβ podría ser responsable de las respuestas celulares inducidas por la sobreexpresión de A2M de los músculos endoteliales y lisos en el útero. arteria espiral descrita anteriormente, que luego resulta en una remodelación vascular inapropiada. Este hallazgo está bien establecido y confirmado por el hecho de que TGFβ1 se expresó en gran medida en los músculos lisos de la arteria espiral uterina de mujeres embarazadas con EP de inicio temprano (Fig. 5c).

Por otro lado, la sobreexpresión de A2M afectaba a la vascularización placentaria, como la coartación del laberinto placentario y la disminución de la expresión de marcadores endoteliales específicos (Caveolin1, CD31) y VEGF (fig. 6). La angiogénesis está involucrada en la proliferación celular, la migración, la adhesión y la formación de tubos [58]. En este estudio, la sobreexpresión de A2M inhibió claramente la migración de HUVEC, probablemente al inhibir la formación de filopodios endoteliales y uniones célula-célula, así como la formación de tubos (Fig. 7a-e). Estos resultados revelaron que la sobreexpresión de A2M provocaba el obstáculo en la vascularización placentaria, lo que provocaría o agravaría la aparición de PE.

Por lo general, se considera que el evento iniciador en la EP de inicio temprano es la isquemia e hipoxia placentarias, que a su vez provocan la liberación de varios factores de origen placentario y, finalmente, afectan la presión arterial materna durante el embarazo [59,60,61]. La proliferación excesiva de células de músculo liso inducida por A2M agravó la remodelación vascular inapropiada, así como la vascularización placentaria aberrante, que pueden ser factores cruciales para la isquemia e hipoxia placentarias. En particular, se demostró que la isquemia y la anoxia están estrechamente asociadas con el nivel de expresión del gen A2M (Fig. 8b). De manera similar, observamos un aumento significativo en los niveles de sFLT-1 y una disminución en los niveles de PIGF en el suero de pacientes con EP en el segundo y/o tercer trimestre del embarazo (Fig. 8c, d), y los niveles de sFLT-1 y PIGF estaban estrechamente asociados. con el nivel de A2M en el plasma materno de las mujeres con preeclampsia (Archivo adicional 1: Fig. S4). Además, se observó claramente una tendencia similar de cambio en los niveles de sFLT-1 y PIGF en el suero de ratas preñadas en ratas con sobreexpresión de A2M (Fig. 8e, f). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de A2M participa en la inducción de la liberación de estos factores de origen placentario en el contexto de isquemia/hipoxia placentaria exacerbada.

El sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) desempeña un papel de vital importancia en el mantenimiento de una circulación uteroplacentaria adecuada en el embarazo normal, así como en el desarrollo de PE [62, 63]. Además, el autoanticuerpo agonista del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1-AA) se descubrió por primera vez en mujeres con EP y puede activar el receptor de angiotensina II tipo 1 en respuesta a la isquemia placentaria, lo que aumenta la vasoconstricción de la vasculatura placentaria [64]. En este estudio, muchos componentes de RAAS y AT1-AA mostraron expresiones anormales en PE (Archivo adicional 1: Fig. S6-S8). Por lo tanto, la desregulación del RAAS podría actuar como un mecanismo posterior de PE en el contexto de la sobreexpresión de A2M.

En resumen, nuestros datos mostraron claramente cómo A2M estaba involucrado en la fisiopatología de la EP. Brevemente, A2M se expresa predominantemente en el músculo liso vascular de la arteria espiral y la vasculatura fetoplacentaria, y su nivel se eleva bajo la influencia del TGFβ1 activado en el contexto de la EP; la alta expresión, a su vez, provoca la proliferación excesiva y la apoptosis reducida de las células del músculo liso vascular en la arteria espiral uterina, así como una migración e invasión insuficientes del trofoblasto (es decir, remodelación inadecuada de la arteria espiral uterina). Mientras tanto, la A2M sobreexpresada en las vellosidades placentarias también restringe en gran medida la angiogénesis placentaria. Los dos resultados integrales exacerban la isquemia/hipoxia placentaria y alteran la liberación de sFLT-1 y PIGF de la placenta, lo que conduce a la aparición de hipertensión materna, proteinuria y restricción del crecimiento fetal, es decir, PE. Además, este trabajo tiene varias limitaciones, como la falta de mecanismos moleculares precisos que subyacen a la participación de A2M en la progresión de la EP, un pequeño número de muestras de PE y de control, y la falta de estudios prospectivos. Finalmente, es importante diseñar experimentos más integrados para abordar completamente el mecanismo fisiopatológico subyacente a la EP. Si es así, podemos esperar que A2M se convierta en un posible biomarcador y objetivo terapéutico para la EP en el futuro.

El intercambio de datos no es aplicable a este artículo ya que no se generaron ni analizaron conjuntos de datos durante el estudio actual.

Alfa-2-macroglobulina

angiotensina II

Autoanticuerpo agonista del receptor de angiotensina II tipo 1

autoanticuerpos AT1R

Factor de crecimiento de fibroblastos básico

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Citotrofoblastos extravellosos

Hematoxilina y eosina

Células musculares lisas de la arteria umbilical humana

Células endoteliales de la vena umbilical humana

Índice de pulsatilidad de la arteria uterina izquierda

Índice de resistencia de la arteria uterina izquierda

Ácido peryódico de Schiff

Solución salina tamponada con fosfato

preeclampsia

Proteína quinasa Cβ

factor de crecimiento de la placenta

Sistema renina-angiotensina-aldosterona

Índice de resistencia de la arteria uterina derecha

Tirosina quinasa-1 similar a fms soluble

Transformando el factor de crecimiento β1

Asesino natural uterino

Factor de crecimiento vascular endotelial

Células musculares lisas vasculares

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Me gustaría agradecer a los obstetras del primer hospital afiliado de la Universidad de Jinan por su apoyo y asistencia en este estudio y agradecer a todas las mujeres embarazadas que participaron en este estudio.

Este estudio fue apoyado por el Proyecto de planificación de ciencia y tecnología de la provincia china de Guangdong (No. 2022A1515012139), el Programa de tecnología de frontera clínica del primer hospital afiliado de la Universidad de Jinan, China (No. JNU1AF-CFTP-2022-a01209) y NSFC subvención (31971108, 32170825 y 31771331). Los patrocinadores no desempeñaron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación o el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Jingyun Wang, Ping Zhang y Mengyuan Liu contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Ginecología y Obstetricia, El Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Jinan, Universidad de Jinan, No.613 Huangpu Road West, Guangzhou, 510632, China

Jingyun Wang, Ping Zhang, Mengyuan Liu, Zhengrui Huang, Xiaofeng Yang, Yuzhen Ding, Jia Liu, Fengxiang Zhang y Ruiman Li

Laboratorio Conjunto Internacional de Desarrollo Embrionario y Medicina Prenatal, División de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Universidad de Jinan, Guangzhou, 510632, China

Jingyun Wang, Ping Zhang, Zhengrui Huang, Xiaofeng Yang, Yuzhen Ding, Xin Cheng, Shujie Xu, Meiyao He, Guang Wang y Xuesong Yang

Quinto Departamento de Medicina (Nefrología/Endocrinología/Reumatología/Neumología), Centro Médico Universitario de Mannheim, Universidad de Heidelberg, Mannheim, Alemania

wang jinyun

División de Histología y Embriología, Laboratorio Clave de Medicina Regenerativa del Ministerio de Educación, Universidad de Jinan, No.601 Huangpu Road West, Guangzhou, 510632, China

Xin Cheng, Shujie Xu, Guang Wang y Xuesong Yang

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JW, PZ, ML y ZH diseñaron y realizaron experimentos. XY, YD y JL recolectaron muestras de pacientes y analizaron datos clínicos. SX, MH y FZ concibieron el estudio. XC proporcionó el apoyo de los análisis estadísticos. GW, RL y XY diseñaron el trabajo y fueron los principales responsables del contenido final. Todos los autores analizaron e interpretaron los datos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Guang Wang, Ruiman Li o Xuesong Yang.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Overseas Hospital, Universidad de Jinan, China (número de aprobación: KY-2021-054) y se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado firmado de todos los participantes del estudio. Todos los procesos experimentales relacionados con tratamientos con animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos del Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Jinan (número de aprobación: 20210302-46).

El trabajo descrito no ha sido publicado antes. No está bajo consideración para su publicación en ningún otro lugar. Este manuscrito ha sido aprobado por todos los coautores.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Anticuerpos para inmunohistoquímica. Tabla S2. Anticuerpos para Western blotting. Tabla S3. Detalles de los kits de Elisa. Tabla S4. Datos estadísticos de experimentos con animales. Resultado complementario 1. Resultado de secuenciación A2M. Resultado complementario 2. Las características clínicas y de laboratorio y los resultados adversos del embarazo de las mujeres embarazadas inscritas en este estudio. Figura S1. Evaluación del desarrollo fetal y placentario en el modelo de rata con sobreexpresión de A2M. Figura S2. Determinación de la migración celular HTR-8/SVneo y la viabilidad celular después de la regulación positiva de A2M. Figura S3. Determinación de la proliferación y apoptosis de células HTR-8/SVneo después de la regulación positiva de A2M. Figura S4. Correlación entre los niveles de PlGF, sFLT-1 y A2M en plasma materno de mujeres con preeclampsia. Figura S5. Determinación de los niveles séricos y placentarios de citoquinas inflamatorias humanas y NF-κB. Figura S6. Determinación de componentes clave del sistema RAAS en suero humano. Figura S7. Determinación de componentes clave del sistema RAAS en suero de rata en presencia de altos niveles de A2M. Figura S8. Ilustración esquemática de los cambios en los componentes clave del sistema RAAS en presencia de niveles altos de A2M.

Datos de origen de transferencia Western.

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Wang, J., Zhang, P., Liu, M. et al. La alfa-2-macroglobulina está involucrada en la aparición de preeclampsia de inicio temprano a través de su impacto negativo en la remodelación de la arteria espiral uterina y la angiogénesis placentaria. BMC Med 21, 90 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02807-9

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Recibido: 12 agosto 2022

Aceptado: 22 de febrero de 2023

Publicado: 09 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02807-9

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