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Apr 20, 2023

beta2

npj enfermedad de parkinson

npj Parkinson's Disease volumen 8, Número de artículo: 61 (2022) Citar este artículo

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Los agonistas de los receptores adrenérgicos β2 (β2AR) se han asociado con un menor riesgo de desarrollar la enfermedad de Parkinson (EP) y se supone que reducen la expresión tanto del ARNm de la alfa-sinucleína (Snca) como de la proteína (α-syn). Dos laboratorios independientes evaluaron los efectos del clenbuterol agonista de β2AR en los niveles de ARNm de Snca y proteína α-syn in vivo (ratas y ratones) y en neuronas corticales primarias de rata. Se observó una disminución modesta en el ARNm de Snca en la sustancia negra después de una dosis aguda única de clembuterol en ratas; sin embargo, esta disminución no se mantuvo después de dosis múltiples. Por el contrario, los niveles de proteína α-syn se mantuvieron sin cambios en los paradigmas de dosificación única y múltiple. Además, el clenbuterol no disminuyó Snca en neuronas corticales primarias de rata cultivadas, ni disminuyó Snca o α-syn en ratones. Además, en comparación con el paradigma de dosis única, la dosis repetida dio como resultado niveles sustancialmente más bajos de clembuterol en plasma y tejido cerebral en roedores. Según nuestras observaciones de una disminución transitoria de Snca y ningún efecto sobre la proteína α-syn en este estudio preclínico, estos datos respaldan la conclusión de que el clembuterol probablemente no sea una estrategia viable para modificar la enfermedad de la EP.

La formación y acumulación de cuerpos de Lewy (LB) intracelulares es una característica patológica clave de la enfermedad de Parkinson (EP). Un componente principal de los LB es la proteína alfa-sinucleína (α-syn), específicamente α-syn, que está mal plegada, agregada y fosforilada en la serina 129 (pSyn)1,2,3,4,5. La agregación de α-syn ocurre en las formas idiopáticas y en la mayoría de las formas familiares de la enfermedad de Parkinson. Las mutaciones en el gen que codifica α-syn (en adelante, SNCA cuando se habla de humanos y Snca cuando se habla de roedores), así como la duplicación y triplicación de SNCA, pueden aumentar la propensión de α-syn a agregarse6,7,8,9. La duplicación o triplicación de SNCA produce un efecto de dosis génica, y la triplicación en comparación con la duplicación conduce a una aparición más temprana de los síntomas y una progresión más rápida de la enfermedad10.

Aunque α-syn se discute comúnmente como una causa patológica que forma agregados asociados con el estado de la enfermedad, la forma soluble monomérica es un componente crucial de la función neuronal. Se ha propuesto que α-syn tiene funciones en el tráfico de vesículas sinápticas y la neurotransmisión, la función mitocondrial, la biosíntesis y el procesamiento de la dopamina, la función de la proteína chaperona, la reparación del ADN y la expresión génica, entre otras funciones predichas11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20. Los niveles inadecuados de α-syn tienen el potencial de ser perjudiciales para las neuronas y la función neuronal, razón por la cual una desactivación o eliminación completa de α-syn probablemente induciría efectos secundarios indeseables21,22. De hecho, los modelos de ratones transgénicos han demostrado que la desactivación de Snca por sí sola es insuficiente para producir efectos23,24, y se requieren desactivaciones simultáneas de Snca, Sncb y Sncg para producir déficits sólidos25,26,27. Estos modelos transgénicos vienen con la advertencia de mecanismos compensatorios significativos asociados con la falta de Snca desde el nacimiento, con hasta 369 genes expresados ​​diferencialmente informados en ratones Snca-/-28.

Los datos acumulativos sugieren que las reducciones moderadas en α-syn tienen el mejor potencial como estrategia terapéutica, es decir, disminuyen los niveles de α-syn mientras se mantiene el umbral crítico requerido para evitar posibles efectos de pérdida de función en las neuronas. Sin embargo, la modulación de los niveles de α-syn en el cerebro no es trivial. Los modelos animales en los que la expresión génica se modificó a través de shRNA o nucleótidos antisentido han tenido resultados mixtos, con algunos estudios que muestran toxicidad29,30, mientras que otros no31,32,33,34. Como alternativa, las intervenciones farmacéuticas pueden proporcionar un enfoque superior para producir una disminución modesta pero fisiológicamente significativa de α-syn.

Se ha informado que los fármacos dirigidos al receptor adrenérgico β2 (β2AR) modulan los niveles de α-syn y afectan el riesgo de EP35,36,37,38,39,40. Los estudios basados ​​en la población han informado una asociación entre el uso de agonistas de β2AR y la disminución del riesgo de EP37,38, aunque otros han cuestionado estos resultados, encontrando que los agonistas de β2AR solos no afectan el riesgo de EP39,40. Más allá de los resultados inconsistentes que rodean a estos estudios de asociación, la evidencia preclínica en roedores y cultivo celular sugiere que los fármacos que actúan sobre el RA-β2 pueden influir en la expresión de α-syn37. Específicamente, se informa que los agonistas de β2AR reducen el ARNm de Snca y la proteína α-syn in vivo e in vitro37. Por el contrario, se ha informado que los antagonistas de β2AR aumentan el ARNm de Snca y la proteína α-syn en cultivo37. Se supone que la alteración de los niveles de α-syn a través de β2AR ocurre a través de la regulación transcripcional por acetilación o desacetilación de H3K27 a lo largo de los sitios promotores y potenciadores de Snca; con agonistas de β2AR o antagonistas de β2AR que conducen a una disminución o aumento en el H3K27 acetilado permisivo, respectivamente, lo que afecta la transcripción de Snca37. Además, se ha informado que el agonista β2AR clenbuterol es beneficioso en modelos que recapitulan las características de la EP. Específicamente, el clenbuterol disminuye el ARNm de SNCA y la proteína α-syn en las iPSC humanas con triplicación de SNCA y previene la neurodegeneración en el modelo de ratón de PD37 con 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP).

El presente conjunto de experimentos es la culminación del trabajo realizado de forma independiente en los laboratorios de la Universidad Estatal de Michigan (MSU) y Biogen. En estos experimentos, buscamos replicar y desarrollar los hallazgos originales de que los agonistas de β2AR, específicamente el clenbuterol, reducen el ARNm de Snca y la proteína α-syn en roedores y cultivos celulares37. Sin embargo, el paradigma de dosificación de clenbuterol utilizado en ratas no dio como resultado una disminución de la proteína α-syn en estudios agudos ni cambios en la proteína Snca o α-syn después de múltiples dosis. Los estudios de replicación directa en ratones reflejaron los resultados observados en ratas, sin que se observara una reducción significativa en la proteína Snca o α-syn después de dosis únicas o múltiples de clembuterol. Además, no hubo cambios en Snca en cultivos corticales primarios de rata. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que cualquier reducción de la transcripción α-syn después del clembuterol es transitoria y no da como resultado una reducción en la abundancia de la proteína α-syn. Por lo tanto, concluimos que es poco probable que el clembuterol se traduzca en un tratamiento efectivo para la EP que modifique la enfermedad.

Primero confirmamos que las neuronas de dopamina nigroestriatal de rata expresan β2AR usando hibridación in situ (Adrb2) combinada con inmunohistoquímica (IHC) para tirosina hidroxilasa (TH) en la sustancia negra (SN). Se observaron abundantes puntos puntuales de ARNm de Adrb2 dentro de las neuronas nigrales inmunorreactivas de TH (THir) individuales (Fig. 1a).

Las ratas recibieron una única inyección intraperitoneal de 10, 20 o 40 mg/kg de clembuterol (clen) o vehículo salino (veh) y se recogió tejido 24 h después de la inyección. una imagen representativa de la hibridación in situ para el ARNm de Adrb2, que codifica β2AR, colocado dentro de neuronas inmunorreactivas de tirosina hidroxilasa (TH) en el SNpc de una rata no tratada. b Snca normalizado a Gapdh y medido a través de ddPCR. c Fracción α-syn fácilmente soluble aislada del SN. d Fracción α-syn inicialmente insoluble aislada del SN, solubilizada con un tampón de lisis más fuerte. e Fracción α-syn fácilmente soluble aislada del cuerpo estriado. f Fracción α-syn inicialmente insoluble aislada del cuerpo estriado, solubilizada con un tampón de lisis más fuerte. Todas las fracciones de proteínas se midieron mediante transferencia Western, se representaron gráficamente como porcentaje del control y las transferencias representativas se muestran debajo del gráfico respectivo. Las columnas indican las medias del grupo, los círculos representan puntos de datos individuales (n = 10 por grupo antes de la eliminación de valores atípicos), las barras de error representan ±1 error estándar de la media. Un asterisco representa significación (p ≤ 0,05). Los valores atípicos se eliminaron en función de la desviación absoluta del método de la mediana. En b, se extrajo una muestra de los grupos veh, 10 y 40 mg/kg, y se extrajeron dos muestras del grupo de 20 mg/kg. No se eliminaron otros valores atípicos.

En base a las inyecciones intraperitoneales (ip) que produjeron niveles significativamente más altos de clembuterol en el LCR en comparación con las inyecciones subcutáneas (Figura 1 complementaria), se seleccionó la administración ip. Para reflejar estudios previos37, administramos una inyección única (ip) de 10, 20 o 40 mg/kg de clembuterol o vehículo (solución salina), se evaluó el ARNm de Snca y la proteína α-syn en el SN, y la proteína α-syn en el striatum 24 h después (ver diseño experimental, Fig. 2 complementaria). Se observó una disminución modesta pero significativa de Snca en el SN usando PCR digital de gotitas (ddPCR) en ratas que recibieron una inyección única de 10 o 20 mg/kg de clenbuterol (Fig. 1b). Snca se redujo ~20 % tanto con la dosis de 10 mg/kg como con la de 20 mg/kg, mientras que no se observó una reducción significativa de Snca en ratas que recibieron la dosis más alta, 40 mg/kg (Fig. 1b).

La preparación de muestras de estriado y nigral de rata para medir la proteína α-syn se realizó mediante una lisis en dos pasos. El primer paso utilizó un tampón de lisis débil y una homogeneización con mano de mortero, para replicar los procedimientos de aislamiento de proteínas como se informó anteriormente37, denominado "α-syn soluble". El segundo paso utilizó un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación fuerte (RIPA) y la sonicación del sedimento restante del primer paso, denominado "α-syn insoluble". No observamos ningún impacto de las inyecciones de clenbuterol ip únicas a ratas en los niveles de proteína α-syn soluble o insoluble en el SN usando cualquier dosis de clenbuterol (Fig. 1c, d). De manera similar, las transferencias de Western para el α-syn fácilmente soluble e insoluble en el cuerpo estriado no mostraron cambios con la administración de clenbuterol (Fig. 1e, f).

La falta de disminución en la proteína α-syn observada después de la administración única de clembuterol, en contraste con la disminución observada en la transcripción, podría deberse a una degradación/depuración inadecuada de la proteína durante el intervalo de 24 h. Esto sugiere que, dado el tiempo adecuado, pueden observarse reducciones en la proteína α-syn. Por lo tanto, para determinar el impacto de la administración de clenbuterol en un paradigma de dosificación múltiple más largo, examinamos los niveles de ARNm de Snca y proteína α-syn con 1 semana de administración repetida de clenbuterol (Figura 3 complementaria). Las ratas recibieron una inyección ip cada 48 h para un total de cuatro dosis, según la vida media de 30 h informada de clembuterol en plasma con administración oral41. Las ratas en los grupos de clenbuterol demostraron una pérdida de peso notable en comparación con los controles con las tres dosis a los 2, 4, 6 y 7 días de la serie de inyecciones (Figura 4 complementaria). Cuando se examinó el ARNm de Snca, no observamos cambios en Snca en el SN con ninguna dosis en el paradigma de inyección múltiple, en contraste con los resultados del paradigma de inyección única (Fig. 2a). Las transferencias Western para α-syn soluble e insoluble en el SN, y el estriado tampoco mostraron cambios en respuesta a ninguna dosis de clembuterol (Fig. 2b-e).

Las ratas recibieron inyecciones intraperitoneales de 10, 20 o 40 mg/kg de clembuterol (clen) o vehículo salino (veh) cada 48 h. El tejido se recogió el séptimo día, 24 h después de la última inyección. Antes de cada inyección, se pesaron las ratas para calcular el volumen de fármaco o vehículo necesario para la dosis. a Snca normalizado a Gapdh y medido a través de ddPCR. b Fracción α-syn fácilmente soluble aislada del SN. c Fracción α-syn inicialmente insoluble aislada de la SN, solubilizada con un tampón de lisis más fuerte. d Fracción α-syn fácilmente soluble aislada del cuerpo estriado. e Fracción α-syn inicialmente insoluble aislada del cuerpo estriado, solubilizada con un tampón de lisis más fuerte. Todas las fracciones de proteínas se midieron mediante transferencia Western, se representaron gráficamente como porcentaje del control y las transferencias representativas se muestran debajo del gráfico respectivo. Las columnas indican las medias del grupo, los círculos representan puntos de datos individuales (n = 10 por grupo antes de la eliminación de valores atípicos), las barras de error representan ±1 error estándar de la media. Un asterisco representa significación (p ≤ 0,05). Los valores atípicos se eliminaron en función de la desviación absoluta del método de la mediana. En a, se extrajeron dos muestras de los grupos de 20 mg/kg y una muestra de los grupos de 40 mg/kg. En b, se extrajeron dos muestras del grupo de 40 mg/kg. En cye, se extrajo una muestra del grupo de 40 mg/kg. No se eliminaron otros valores atípicos.

Mittal et al.37 han examinado previamente los efectos del clembuterol en la expresión de α-syn en ratones. En su estudio, los ratones recibieron una sola inyección ip de clembuterol (10 mg/kg) disuelto en solución salina o un volumen igual de solución salina como control. Los animales se procesaron 24 h después de la inyección y se informó una disminución del 20% al 50% tanto en el ARNm de Snca como en la proteína α-syn en el SN37. Para determinar si los efectos del clembuterol son específicos de los ratones, realizamos un estudio utilizando parámetros idénticos a los informados anteriormente (Fig. 2 complementaria)37.

En el SN, el ARNm de Snca en animales tratados con clembuterol tendió a disminuir, pero el efecto no fue significativo (Fig. 3a). Los resultados de un estudio replicado realizado en Biogen usando el mismo paradigma de dosis única y punto de tiempo tampoco observaron cambios en el ARNm de Snca (Fig. 3b). La evaluación de la proteína α-syn por transferencia Western se realizó nuevamente usando una lisis en dos pasos. Tanto en las fracciones solubles como en las insolubles, no observamos una disminución en la proteína α-syn en el SN (Fig. 3c, d). En el cuerpo estriado, hubo un aumento significativo, aunque leve, de α-syn soluble en el grupo de clenbuterol, que fue del 109,1 % ± 2,41 del control (Fig. 3e). Sin embargo, no hubo un aumento detectable de α-syn insoluble en el grupo tratado con clembuterol (Fig. 3f).

Los ratones recibieron una única inyección intraperitoneal de 10 mg/kg de clembuterol (clen) o vehículo salino (veh) y se recogió tejido 24 h después de la inyección. a Snca normalizado a Gapdh y medido a través de ddPCR. b Resultados del laboratorio de Biogen, ARNm de Snca normalizado a ARNm de Rpl13a y medido mediante RT-qPCR. c Fracción α-syn fácilmente soluble aislada del SN. d Fracción α-syn inicialmente insoluble aislada del SN, solubilizada con un tampón de lisis más fuerte. e Fracción α-syn fácilmente soluble aislada del cuerpo estriado. f Fracción α-syn inicialmente insoluble aislada del cuerpo estriado, solubilizada con un tampón de lisis más fuerte. Todas las fracciones de proteínas se midieron mediante transferencia Western, se representaron gráficamente como porcentaje del control y las transferencias representativas se muestran debajo del gráfico respectivo. Las columnas indican las medias del grupo, los círculos representan puntos de datos individuales (n = 10 por grupo antes de la eliminación de valores atípicos), las barras de error representan ±1 error estándar de la media. Un asterisco representa significación (p ≤ 0,05). Los valores atípicos se eliminaron en función de la desviación absoluta del método de la mediana. En a, se extrajeron dos muestras del vehículo y una muestra de los grupos clen. No se eliminaron otros valores atípicos.

Teniendo en cuenta la posibilidad de que el inicio de los efectos del clembuterol se retrase, examinamos el impacto de inyecciones múltiples de 10 mg/kg de clembuterol en ratones durante 1 semana (Fig. 3 complementaria). No hubo cambios en el ARNm de Snca en el SN después del paradigma de tratamiento de 1 semana (Fig. 4a). De manera similar, no observamos ningún impacto de las inyecciones múltiples en la proteína α-syn en el SN de ratón mediante transferencia Western, ya sea en la fracción soluble o insoluble (Fig. 4b, c). De manera similar, no hubo cambios en las fracciones insolubles o insolubles de α-syn en el cuerpo estriado después de 1 semana (Fig. 4d, e). En comparación con el vehículo, los ratones que recibieron clenbuterol perdieron peso al principio de este paradigma de dosificación, pero se recuperaron y no mostraron una pérdida de peso significativa en el cuarto día de las inyecciones y más allá (Fig. 4 complementaria).

Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de 10 mg/kg de clembuterol (clen) o vehículo salino (veh) cada 48 h. El tejido se recogió el séptimo día, 24 h después de la última inyección. a Snca normalizado a Gapdh y medido a través de ddPCR. b Fracción α-syn fácilmente soluble aislada del SN. c Fracción α-syn inicialmente insoluble aislada de la SN, solubilizada con un tampón de lisis más fuerte. d Fracción α-syn fácilmente soluble aislada del cuerpo estriado. e Fracción α-syn inicialmente insoluble aislada del cuerpo estriado, solubilizada con un tampón de lisis más fuerte. Todas las fracciones de proteínas se midieron mediante transferencia Western, se representaron gráficamente como porcentaje del control y las transferencias representativas se muestran debajo del gráfico respectivo. Las columnas indican las medias del grupo, los círculos representan puntos de datos individuales (n = 10 por grupo antes de la eliminación de valores atípicos), las barras de error representan ±1 error estándar de la media. Un asterisco representa significación (p ≤ 0,05). Los valores atípicos se eliminaron en función de la desviación absoluta del método de la mediana. En a, se extrajo una muestra de los grupos veh y clen. No se eliminaron otros valores atípicos.

Como se mostraron disminuciones en la proteína α-syn a través de un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) en el informe original37, también analizamos cohortes de ratones usando un ELISA disponible comercialmente. No observamos ningún impacto del clenbuterol en los niveles de proteína α-syn soluble o insoluble en el SN o el cuerpo estriado a las 24 h en los ratones tratados de forma aguda (Fig. 5a, c, e, g). En el paradigma de 1 semana, no hubo cambios en los niveles de proteína α-syn soluble o insoluble en el SN, y no hubo cambios en los niveles de proteína α-syn soluble en el cuerpo estriado (Fig. 5b, d, f). Observamos un aumento significativo en la proteína α-syn en el cuerpo estriado en la fracción insoluble, 34,9 ± 1,9 pg/µg en el grupo de clembuterol de 1 semana en comparación con 27,9 ± 1,6 pg/µg en el grupo de control con vehículo (Fig. 5h) . Los ELISA y una parte de las transferencias Western en el informe original usaron un anticuerpo α-syn diferente (Millipore, MABN1817, α-syn clone 2F12) que el que usamos nosotros (Abcam, ab212184). Desafortunadamente, no teníamos lisado restante del SN para hacer una segunda evaluación de los niveles de α-syn usando este otro anticuerpo. Sin embargo, para abordar esta diferencia, interrogamos aún más la fracción soluble del cuerpo estriado. Nuevamente, no hubo cambios por transferencia Western en la fracción soluble del estrato en el paradigma de 24 h o 1 semana usando el anticuerpo MABN1817 (Fig. 5 complementaria).

Se usó un kit ELISA comercialmente disponible para medir α-syn en el plasma y los lisados ​​de proteínas restantes de los paradigmas de dosificación de 10 mg/kg de ratón de 1 día y 1 semana. α-syn fácilmente soluble aislado de la SN en 1 día yb 1 semana. Inicialmente α-syn insoluble aislado de SN, solubilizado con un tampón de lisis más fuerte en c 1 día y d 1 semana. α-syn soluble del cuerpo estriado en e 1 día yf 1 semana. α-syn insoluble del cuerpo estriado en g 1 día y h 1 semana. α-syn total en plasma en i 1 día yj 1 semana. Las columnas indican las medias del grupo, los círculos representan puntos de datos individuales (n = 10 por grupo antes de la eliminación de valores atípicos), las barras de error representan ±1 error estándar de la media. Un asterisco representa significación (p ≤ 0,05). Los valores atípicos se eliminaron en función de la desviación absoluta del método de la mediana. En a, no se eliminaron los valores atípicos, el pequeño tamaño de la muestra en el grupo veh se debió a la cantidad limitada de proteína restante para el ensayo. En b, se extrajo una muestra de los grupos veh y clen. En i, j se eliminó una muestra del grupo veh. No se eliminaron otros valores atípicos.

Una diferencia restante entre nuestra preparación de muestras y la de Mittal et al.37 fue que todas las ratas y ratones en nuestros estudios fueron perfundidos con solución salina para eliminar el potencial de la proteína α-syn en la sangre que contribuiría a los niveles de α-syn en el tejido cerebral. . Para determinar si el clenbuterol afecta los niveles de proteína α-syn en sangre, medimos la proteína α-syn en plasma. No observamos diferencias en los niveles de proteína α-syn en plasma en ratones para el paradigma de 24 ho de 1 semana después de la inyección de 10 mg / kg de clenbuterol (Fig. 5i, j).

En conjunto, observamos, tanto en ratas como en ratones, que la capacidad del clembuterol para reducir α-syn se limitaba a una reducción en la transcripción de α-syn después de una sola inyección, que ya no era observable en el paradigma de inyección múltiple. β2AR está sujeto a desensibilización con la exposición crónica al agonista42. La desensibilización de β2AR puede ser seguida por la internalización y/o regulación a la baja del receptor. Para examinar los cambios potenciales en β2AR, el tejido del cuerpo estriado y el hipocampo primero se homogeneizó en un tampón de lisis fuerte y se evaluó mediante transferencia Western. La proteína β2AR total no cambió después de una semana de tratamiento con clenbuterol en el cuerpo estriado y el hipocampo (Fig. 6a, b complementarias). Un marcador para β2AR internalizado es la fosforilación de serinas 355/356 por el receptor quinasa acoplado a proteína G43. El β2AR fosforilado (ser355/356) no cambió después de una semana de tratamiento con clenbuterol en el cuerpo estriado, así como en el hipocampo (Fig. 6c, d complementarias). Tomados en conjunto, estos resultados no respaldan que la internalización o la regulación negativa del receptor β2AR ocurrieron con la administración repetida de clembuterol. Sin embargo, estos hallazgos no pueden descartar la desensibilización funcional, donde la unión del agonista produce una respuesta más débil.

Un criterio de valoración adicional que examinamos fueron los niveles de proteína del transportador de dopamina (DAT), que se requiere para la absorción de MPP+, el metabolito tóxico de MPTP44,45. No medido previamente en el contexto del uso de clenbuterol, una disminución de DAT mediada por clenbuterol podría explicar potencialmente los efectos neuroprotectores informados para clenbuterol en el modelo de ratón MPTP37. En el cuerpo estriado de ratones, una sola inyección de 10 mg/kg de clembuterol redujo significativamente los niveles de proteína DAT en ~23 % en comparación con el control (Fig. 7a complementaria). Esta reducción en DAT estriatal no se observó en el paradigma de inyección múltiple (Fig. 7b complementaria). Además, la proteína DAT del cuerpo estriado no cambió en ratas después de una sola inyección de clembuterol o después de múltiples inyecciones (Fig. 7c, d complementarias).

Clenbuterol en el plasma y el cerebro (hipocampo) se midió para determinar los niveles presentes en ratas y ratones. En los paradigmas de inyección única y múltiple en ratas, se observó un aumento dependiente de la dosis en los niveles de clembuterol unido y no unido en plasma y tejido (Fig. 6a, c, e). Sorprendentemente, los niveles de clembuterol medidos en animales que recibieron múltiples inyecciones fueron significativamente más bajos que sus contrapartes de una sola inyección (Fig. 6a, c, e). Los niveles de clembuterol en la fracción unida de los grupos de inyección única fueron ~7, 14 y 32 veces más altos que sus respectivas contrapartes de inyección múltiple de 10, 20 y 40 mg/kg. Los niveles de clembuterol en la fracción libre de los grupos de inyección única fueron ~4, 10 y 10 veces más altos que sus respectivas contrapartes de inyección múltiple de 10, 20 y 40 mg/kg. Los niveles totales de clembuterol en plasma de los grupos de inyección única fueron ~4, 3 y 10 veces más altos que sus respectivas contrapartes de inyección múltiple de 10, 20 y 40 mg/kg. Si bien se esperaba el aumento dependiente de la dosis en los niveles de clembuterol en plasma y tejido, no se esperaba la disminución de los niveles después de una serie de inyecciones en comparación con una sola inyección. De manera similar, en ratones, el clembuterol en plasma y tejido fue menor después de múltiples inyecciones en comparación con una sola inyección (Fig. 6b, d, f). En el grupo de inyección única, los niveles de clembuterol en las fracciones unida y no unida fueron ~7 y 3 veces más altos en plasma, respectivamente, en comparación con el grupo de inyección múltiple. Dado que los grupos de inyección única y múltiple fueron sacrificados ~ 24 h después de su inyección final, la expectativa sería que los niveles de clembuterol serían comparables o más altos en el grupo de inyección múltiple debido a la acumulación.

Se recogieron tejido del hipocampo y plasma de ratones y ratas en los paradigmas de 1 día y 1 semana. Se trató el tejido para separar el clembuterol (clen) que interactuaba y no interactuaba con las proteínas, produciendo una fracción de clembuterol unido y no unido, respectivamente. Clenbuterol unido en ratas y ratones b. Clenbuterol no unido en la rata c y ratones d. Clenbuterol total en el plasma de ratas e y ratones f. Las columnas indican las medias del grupo, los círculos representan puntos de datos individuales (n = 5 por grupo), las barras de error representan ±1 error estándar de la media. Una línea que conecta las columnas indica significación entre grupos (p ≤ 0,05).

Al igual que Mittal et al.37, las neuronas corticales primarias de rata de embriones de rata E18 Sprague-Dawley se trataron durante 2 días con clembuterol (1, 5, 10 o 20 µM), luego se evaluó el ARNm de Snca mediante RT-qPCR. A diferencia del informe anterior37, el clenbuterol no tuvo ningún efecto sobre la transcripción de α-syn en ninguna concentración (Fig. 7a). El ensayo de viabilidad celular correspondiente no mostró toxicidad significativa asociada con ninguna de las concentraciones de clembuterol utilizadas. (Figura 7b).

Las neuronas corticales primarias de rata E18 se trataron con clembuterol o vehículo. a Snca medido a través de RT-qPCR en neuronas expuestas en DIV11 y recolectadas 2 días después. b Viabilidad celular de neuronas primarias expuestas en DIV11 y examinadas 2 días después. Las columnas indican las medias del grupo, los círculos representan puntos de datos individuales del mismo experimento, las barras de error representan ±1 error estándar de la media. Un asterisco representa significación (p ≤ 0,05).

El uso de agonistas y antagonistas de β2AR con respecto a la EP y el riesgo de EP ha sido un tema de debate. Se demostró inicialmente que los agonistas de β2AR disminuyen el riesgo de EP en una población noruega37. Cuando se examinó en una cohorte de EE. UU. y se ajustó por tabaquismo, el uso de agonistas β2AR no tuvo efecto sobre el riesgo de EP39. Una cohorte separada de Israel también informó el uso de agonistas β2AR para disminuir el riesgo de EP, incluso cuando el tabaquismo, el consumo de alcohol, la residencia y otras variables se incluyeron en el análisis38. Más recientemente, se informó que los agonistas de β2AR disminuyen el riesgo de EP en pacientes no diabéticos, mientras que aumentan el riesgo en aquellos con diabetes40. Con respecto a los antagonistas de β2AR y la EP, hay informes que sugieren un vínculo con un mayor riesgo37,38, los que no muestran asociación46 y los que observaron una asociación hasta ajustar por exposición sostenida, un retraso de 5 años entre la exposición y el diagnóstico de la EP, o un antagonista específico propranolol35,36,39,40. El uso de propranolol asociado con un mayor riesgo de EP viene con la advertencia de que se usa para tratar el temblor esencial, que a su vez está asociado con un mayor riesgo de EP38,39,40,47. En resumen, sin un consenso claro en los datos de asociación de la población, los estudios de laboratorio controlados son fundamentales para proporcionar información clave para determinar el potencial de los agonistas β2AR para el tratamiento de la EP.

En estudios preclínicos, se ha demostrado que el clembuterol en ratones y estudios de cultivos celulares disminuye la expresión de α-syn a través de modificaciones de histonas, lo que da como resultado reducciones en el ARNm de Snca y la proteína α-syn después de una sola administración37. En el presente estudio pudimos replicar parcialmente las observaciones de Mittal et al.37. Específicamente, observamos una reducción significativa en el ARNm de Snca o una tendencia hacia la disminución; sin embargo, en ninguna de las especies detectamos una reducción en la proteína α-syn luego de una sola inyección de clembuterol en ratas o ratones. Para comprender el impacto de la administración repetida de clenbuterol en el ARNm de Snca y la proteína α-syn no examinada previamente por Mittal et al.37, también examinamos los efectos en un paradigma de inyección múltiple. La administración repetida de clenbuterol no disminuye la transcripción o la proteína en ratones o ratas. Además, el clembuterol tampoco tiene efecto sobre el ARNm de Snca en cultivos corticales primarios. Por lo tanto, mientras que nuestros resultados actuales replican el hallazgo anterior de que una sola administración de clembuterol puede reducir el ARNm de Snca, al expandir nuestro análisis para incluir el efecto de la administración repetida de clembuterol durante 1 semana, hemos revelado que cualquier reducción del ARNm de Snca parece ser a corto plazo. Es importante destacar que no se observó el impacto en la reducción de la proteína α-syn en ninguno de los dos paradigmas de administración de clembuterol.

Se demostró que los agonistas de β2AR salmeterol y clenbuterol tienen propiedades neuroprotectoras contra MPTP37,48. Sin embargo, el mecanismo por el cual los agonistas de β2AR proporcionaron esta neuroprotección no está claro y los resultados vienen con ciertas advertencias. En ambos informes, el agonista β2AR se administró antes y durante las inyecciones de MPTP37,48, lo que brinda la oportunidad de una interacción directa entre el fármaco y la agresión con MPTP, disminución del metabolismo de MPTP por MAO-B en su metabolito tóxico MPP+, disminución de la captación de MPP+ en las neuronas a través de DAT, o reducción de la neuroinflamación. En nuestro presente estudio, observamos que la administración aguda de clembuterol se asoció con una pequeña reducción de DAT en ratones. Esto plantea la posibilidad de que la reducción mediada por clenbuterol en los niveles y/o la función de DAT interfiriera con la captación de MPP+, disminuyendo así la toxicidad inicial de MPTP y produciendo un efecto pseudo-neuroprotector.

Aunque MPTP produce una degeneración selectiva de la vía nigroestriatal, no produce una patología robusta de α-syn49,50. La falta de inclusiones patológicas de α-syn en este modelo sugiere que las disminuciones mediadas por clenbuterol en α-syn patológico probablemente no sean el mecanismo de neuroprotección informado en el modelo MPTP37. Se observa que los ratones nulos transgénicos α-syn son resistentes a la toxicidad aguda y crónica inducida por MPTP51, lo que podría implicar la pérdida de α-syn en la neuroprotección en el modelo MPTP. Sin embargo, la resistencia al inhibidor del complejo I mitocondrial rotenona no se observa en las neuronas del mesencéfalo embrionario nulo α-syn51. Estos resultados algo contradictorios plantean la posibilidad de que los cambios genéticos compensatorios asociados con la pérdida de α-syn durante el desarrollo28 puedan participar en la neuroprotección de MPTP en ratones sin α-syn y no en la pérdida de α-syn per se.

Es razonable esperar que se requiera la administración crónica de agonistas de β2AR para que sea eficaz para la modificación de la enfermedad de EP. En el presente estudio, solo se observó una reducción significativa en el ARNm de Snca en ratas en el paradigma de inyección única de clembuterol. Además, con la dosis más alta en ratas (40 mg/kg), no se observó ningún cambio en el ARNm, lo que sugiere una curva dosis-efecto en forma de U invertida con clembuterol agudo. No se detectaron disminuciones en el ARNm de Snca después de múltiples inyecciones durante una semana, lo que sugiere taquifilaxia asociada con el clembuterol. La disminución de los niveles de clembuterol después de la administración repetida dificulta determinar si el agonismo sostenido de β2AR podría reducir la proteína α-syn. Es posible que un agonista de β2AR diferente que no esté sujeto a taquifilaxia pueda disminuir la α-syn. Como se mencionó anteriormente, la estimulación prolongada de β2AR puede provocar la desensibilización, la internalización y la regulación a la baja del receptor. Se ha demostrado que dosis de clembuterol tan bajas como 0,5 mg/kg dos veces al día durante 4 a 7 días provocan una desensibilización funcional de los RA-β2 corticales52. Dosis tan bajas como 0,3 mg/kg dos veces al día durante 14 días y 0,25 mg/kg una vez al día durante 10 días han provocado la desensibilización del receptor en la aorta y el útero de rata, respectivamente53,54. Aunque no pudimos observar una disminución en la fosforilación de β2AR o su abundancia en el presente estudio, sigue siendo posible que ocurra una desensibilización funcional de β2AR después de la administración repetida de clenbuterol. Esto proporciona una posible explicación de por qué la dosis única se asoció con una disminución del ARNm de α-syn pero no con el paradigma de dosificación repetida. Otra posibilidad para los diferentes efectos sobre el ARNm de α-syn observado con paradigmas de dosificación única frente a múltiples es que la administración repetida de clembuterol acelera su propio metabolismo. De hecho, tanto en el cerebro como en el plasma, observamos niveles más bajos de clembuterol después del paradigma de inyección múltiple en comparación con la inyección única. Clenbuterol es un sustrato de las enzimas CYP1a1 y CYP1a255 del citocromo P450, y su administración a pollos eleva el citocromo microsomal hepático P45056. En conjunto, la naturaleza transitoria de la reducción del ARNm de Snca observada con el paradigma de dosis única combinada con reducciones no detectables en la proteína α-syn en cualquier paradigma inducida por el agonista β2AR clenbuterol, plantea dudas sobre si los agonistas β2AR proporcionarían algún beneficio a largo plazo como una terapia que reduce el riesgo o modifica la enfermedad para la enfermedad de Parkinson.

Otro concepto a considerar son las dosis efectivas y tóxicas del agonista β2AR. En ratones, se informó que se requerían 10 mg/kg de clembuterol para disminuir la α-syn, lo que da como resultado ~20 ng/g de clembuterol en el tejido cerebral 24 h después de la inyección37. Aunque el clenbuterol no está aprobado por la FDA para su uso en humanos, con frecuencia se toma como un suplemento de venta libre para perder peso y desarrollar músculos. En humanos, las dosis tomadas son del orden de 20 a 100 microgramos, con efectos adversos como taquicardia, dolor torácico, palpitaciones, temblor e isquemia miocárdica informados en algunos casos a estas dosis57,58,59,60. En modelos de roedores, el clembuterol crónico puede dañar el tejido miocárdico61,62. Estos posibles efectos secundarios adversos asociados con dosis relativamente bajas pueden limitar el potencial terapéutico del clembuterol. Se recomendaría una precaución similar con el uso de otros agonistas de β2AR de acción prolongada si el objetivo fuera obtener niveles cerebrales a la par con lo que se informa que se requiere en ratones para disminuir α-syn.

Nuestro presente estudio se centró en el efecto del clembuterol específicamente en la proteína α-syn, sin embargo, no podemos excluir el potencial de los agonistas β2AR para proporcionar neuroprotección y/o beneficio sintomático en la EP a través de otros mecanismos. Se ha demostrado que los agonistas de β2AR en modelos animales aumentan el transporte a través del gran sistema de aminoácidos neutros, aumentando el transporte de L-tirosina para la síntesis de dopamina, así como de levodopa a través de la barrera hematoencefálica63,64,65,66,67,68. Se informó que el agonista β2AR comúnmente utilizado para el asma, el albuterol, produce una mejoría en algunos síntomas motores de la EP cuando se usa como terapia adjunta a la levodopa63,64. Además, se ha demostrado que los agonistas de β2AR tienen propiedades antiinflamatorias asociadas con la neuroprotección. Reducción de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (IBA1) y grupo marcador fagocítico de la molécula de diferenciación 68 (CD68) microglía positiva en respuesta a rotenona69, reducción de la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) y grupo de molécula de diferenciación 11B (CD11b) expresión de ARNm en hipocampo en respuesta al ácido kaínico70, supresión de la proliferación de microglía71, factor de necrosis tumoral alfa reducido (TNF-α) e interleucina 6 (IL-6) en respuesta a los lipopolisacáridos (LPS)72,73, TNF-α reducido y óxido nítrico de Se han informado microglía y neuroprotección de LPS48. También se ha demostrado que los agonistas de β2AR aumentan los factores neurotróficos, como el factor de crecimiento nervioso y el factor neurotrófico derivado del cerebro70,74,75. Además de los modelos de EP, se ha informado que los agonistas de β2AR son neuroprotectores en modelos preclínicos de accidente cerebrovascular isquémico76 y excitotoxicidad70, promueven la neurogénesis, la ramificación dendrítica y disminuyen las placas amiloides cerebrales en el modelo de Alzheimer de ratón transgénico APP/PS1, y producen beneficios motores en el SOD1G93A modelo de ratón transgénico ALS77.

En conclusión, nuestros resultados in vivo actuales en dos especies y los resultados in vitro, realizados en dos laboratorios separados, demuestran que la capacidad del clembuterol para reducir α-syn es transitoria y se limita a disminuciones modestas en el ARNm de α-syn pero no en la proteína. Nuestros resultados demuestran que estos efectos mínimos se pierden con la administración repetida, quizás debido a la desensibilización del receptor β2AR y/o al aumento del metabolismo del fármaco. Con base en estos hallazgos, concluimos que el clenbuterol agonista de β2AR per se no tiene potencial para reducir α-syn como una estrategia modificadora de la enfermedad para la EP.

Se compraron ratas Fischer 344 macho de tres meses de edad (n = 90) de Charles River Laboratories; Se adquirieron ratones C57BL/6 J macho de ocho semanas de edad (n = 40) en Jackson Laboratory. Las ratas se alojaron 1-3 por jaula y los ratones se alojaron 5 por jaula en una habitación en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, y se proporcionó comida y agua ad libitum. Todo el trabajo con animales se realizó en el vivero del Centro de Investigación del Estado de Michigan en Grand Rapids de la Universidad Estatal de Michigan. Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC) en la Universidad Estatal de Michigan.

Clenbuterol HCl (Sigma-Aldrich C5423; Lot# BCBQ2163V) en polvo se almacenó a 4 °C antes de su uso. Aproximadamente 30 a 60 minutos antes de las inyecciones, el clembuterol se diluyó en solución salina estéril al 0,9 % a una concentración de 5 mg/mL en base a la base libre, luego se agitó en vórtex hasta que se disolvió por completo. Los animales se pesaron y luego recibieron una inyección intraperitoneal (ip) o subcutánea (sc) de la cantidad adecuada de solución basada en el peso para administrar 10, 20 o 40 mg/kg de clembuterol. Los grupos de control del vehículo recibieron solución salina al 0,9% en peso en un volumen igual al volumen más alto administrado a la especie: ratones (10 mg/kg) o ratas (40 mg/kg). En estudios de dosis múltiples, las inyecciones se realizaron en días alternos, aprovechando la vida media de ~30 h41 para mantener los niveles de clembuterol presentes todo el tiempo. Todos los pesajes e inyecciones se realizaron por la mañana, sacrificando a los animales y recolectando tejido/plasma el día después de la última inyección.

Los animales se sacrificaron con una sobredosis de pentobarbital (Beuthanasia-D Special, Merck Animal Health) (30 mg/kg). Para recolectar LCR, las ratas se aseguraron en un instrumento estereotáctico modificado para sostener un juego de venas de cuero cabelludo de mariposa (Exel International, 26708). La aguja se introdujo en la cisterna magna, se extrajo el líquido cefalorraquídeo y se almacenó durante un período breve en hielo. El LCR se centrifugó (10 000 × g durante 10 min a 4 °C) para eliminar trazas de sangre y luego se almacenó a -80 °C. Para recolectar plasma, se extrajo sangre cardíaca con una jeringa heparinizada, se transfirió a un tubo de recolección de sangre BD Vacutainer™ (BD 367862), se invirtió para mezclar y se mantuvo en hielo hasta que se pudieron procesar las muestras. La sangre se centrifugó (3000 RPM durante 5 min a 4 °C), el plasma se recogió y almacenó a -80 °C. Inmediatamente después de la recolección de sangre cardíaca, las ratas se perfundieron intracardiacamente y los ratones se perfundieron transcardiacamente con solución salina heparinizada helada (0,9 %) para eliminar la sangre del cerebro que podría complicar los resultados. Se extrajeron los cerebros y se congelaron rápidamente en 2-metilbutano sobre hielo seco, luego se almacenaron a -80 °C. Los cerebros se montaron y seccionaron en las regiones de interés en un criostato a -15 °C, luego las regiones de interés (estriado, sustancia negra, hipocampo) se microdisectaron y recolectaron en tubos de microcentrífuga. El tejido recolectado para transferencias Western, ELISA y espectrometría de masas se mantuvo en hielo seco y luego se almacenó a -80 °C. El tejido recolectado para la PCR digital de gotas (ddPCR) se agregó a tubos de microcentrífuga libres de DNasa/RNasa que contenían 100 µL de reactivo TRIzol (Invitrogen 26696026), se homogeneizó con un mortero desechable, el volumen de reactivo TRIzol se llevó a 1 mL, se mezcló mediante pipeteo, se congeló en hielo seco y almacenado a -80 °C.

Las muestras en TRIzol se descongelaron en hielo y se centrifugaron brevemente para recolectar todo el líquido en el fondo del tubo. Los tubos de microcentrífuga Phasemaker (Invitrogen, A33248) se prepararon centrifugando durante 30 s a 16 000 × g. Cada muestra se transfirió a un tubo Phasemaker y se incubó a TA durante 5 min, seguido de la adición de 200 µL de cloroformo. Los tubos se agitaron a mano, se incubaron a TA durante 10 min y se centrifugaron durante 5 min a 16 000 × g a 4 °C. La fase acuosa (líquido transparente) se transfirió a un tubo libre de ARNasa, se añadió un volumen igual de etanol al 100 % y las muestras se agitaron brevemente. Se usó un kit de purificación de ácido nucleico en columna (Zymo Research, R1016) para procesar más las muestras con métodos modificados a partir de las instrucciones del fabricante. La muestra se añadió 600 µL a la vez a la columna y se centrifugó durante 1 min a 12 000 × g, esto se repitió hasta que se usó toda la muestra. Todos los pasos de tampón de preparación/lavado de ARN se realizaron agregando el tampón a la columna y centrifugando durante 1 min a 12 000 × g. Después de cargar las muestras en las columnas, las muestras se lavaron con 400 µl de tampón de lavado de ARN. Se añadió a la columna un cóctel de ADNasa I 1X (DNasa I de Thermo Scientific FEREN0521; tampón de reacción con MgCl2 de Thermo Scientific FERB43), que se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. Después de centrifugar el cóctel de ADNasa I a través de la columna, se añadieron 400 µl de tampón de preparación de ARN y se pasaron a través de la columna. Las columnas se lavaron dos veces con tampón de lavado de ARN, 700 µl y luego 400 µl respectivamente, luego se secaron durante 2 min a 12 000 × g. Se añadió agua libre de ADNasa/RNasa (15 µl), las columnas se incubaron durante 1 min a temperatura ambiente y el ARN se eluyó mediante centrifugación (1 min a 10 000 × g). La calidad y la cantidad de ARN se evaluaron con un bioanalizador Agilent 2100 utilizando un kit Agilent RNA 6000 Pico (5067-1513). Antes de almacenar el ARN a -80 °C, el ARN se diluyó a 1 ng/µL con agua libre de ADNasa/RNasa y se dividió en alícuotas.

El ARN se descongeló y se usaron 2 ng con iScript Reverse Transcription Supermix para la síntesis de ADNc (Bio-Rad, 1708841). La síntesis de ADNc se realizó en un termociclador con los siguientes ajustes: 5 min a 25 °C, 20 min a 46 °C, 1 min a 95 °C, mantener a 4 °C (temperatura constante de la tapa de 105 °C). En caso de que fuera necesario el almacenamiento a -20 °C, todo el ADNc se diluyó con tampón de almacenamiento de ADNc 2X (partes iguales de Tris HCl 10 mM (pH 7,5) y EDTA 0,1 mM pH (8,0)). Para preparar las muestras para la PCR digital de gotas (ddPCR), el ADNc se descongeló si era necesario en hielo y se preparó una mezcla maestra que contenía 2X ddPCR Supermix for Probes (Bio-Rad, 186-3026) y los conjuntos de sondas de cebador Taqman 20X. Las sondas utilizadas para ratones fueron Snca (Applied Biosystems #4331182, Mm01188700_m1, FAM-MGB); y dos sondas de referencia diferentes, Gapdh (Applied Biosystems #4331182, Mm99999915_g1, VIC-MGB) y Rpl13 (Applied Biosystems #4331182, Mm02342646_g1, VIC-MGB). Los resultados normalizados a Rpl13 se pueden encontrar en la figura complementaria 8. Las sondas utilizadas para ratas fueron Snca (Applied Biosystems #4331182, Rn00569821_m1, FAM-MGB) y la sonda de referencia fue Gapdh (Applied Biosystems #4331182, Rn01749022_g1, VIC-MGB). Para todos los conjuntos de sondas de cebadores Taqman utilizados, la sonda se extendió a través de una unión exón-exón. Se añadieron partes iguales de ADNc y mezcla maestra a los tubos, se mezclaron, se centrifugaron brevemente y se añadieron 20 µl a los pocillos de muestra de los cartuchos generadores de gotas DG8 (Bio-Rad, 1864008). A los pozos de petróleo del cartucho, se añadieron 70 µl de aceite de generación de gotitas (Bio-Rad, 1863005). Se aseguró una junta de goma (Bio-Rad, 1863009) sobre el cartucho, y se usó un generador de gotas QX (Bio-Rad, 186-4002) para producir gotas que contenían ARN. Desde el pocillo de gotitas del cartucho, se transfieren 40 µL de gotitas a una placa de 96 pocillos (Bio-Rad, 12001925). Cuando se transfirieron todas las muestras, la placa se selló con una lámina perforable (Bio-Rad, 181-4040) mediante un sellador de placas (Bio-Rad, 181-4000). Las placas se transfirieron a un termociclador (Bio-Rad, C1000), con los siguientes ajustes: 10 min a 95 °C, 39 ciclos (30 s a 94 °C, 1 min a 60 °C), 10 min a 98 °C , mantener a 12 °C (temperatura constante de la tapa de 105 °C). Después de la PCR, las placas se transfieren al lector de gotas QX200 (Bio-Rad, 1864003) y los resultados se analizan con el software QuantaSoft. Para todas las muestras, el gen de interés se normalizó al gen de referencia. Gapdh fue elegido como uno de los genes de referencia, ya que es un gen y una proteína de mantenimiento de uso convencional, y muestra una expresión de ARNm alta y consistente en la mayoría de los tejidos. También se usó un gen de referencia adicional, Rpl13a, porque el gen relacionado Rpl13 se usó en Mittal et al.37, que originalmente informaron los efectos del clembuterol en el ARNm de Snca y la proteína α-syn. El uso de diferentes genes de referencia para la normalización no afectó a los resultados generales.

La preparación de la muestra para examinar la proteína α-syn se realizó en dos pasos, una lisis débil inicial como la realizada por Mittal et al.37 y una segunda etapa de lisis fuerte en el sedimento restante. Se extrajeron muestras de tejido congelado de -80 °C, 100 µL y 200 µL de tampón de lisis débil (sacarosa 320 mM, NaF 5 mM, Na3VO4 1 mM, Tris 10 mM (pH 7,4), EGTA 1 mM, EDTA 1 mM) agregado al SN y al cuerpo estriado respectivamente. El tejido se homogeneizó con un mortero desechable, se incubó en hielo durante 10 min y se centrifugó durante 10 min a 10 000 × g a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó nuevamente durante 10 min a 10 000 × g a 4 °C, y se recogió el sobrenadante, quedando solo un pequeño sedimento, si lo hubiera. Se añadió tampón de lisis RIPA (Santa Cruz Biotechnology, sc-24948) igual a la cantidad original de tampón de lisis débil al sedimento restante de la centrifugación inicial de la fracción de lisis débil. El precipitado en tampón RIPA se homogeneizó con 2–4 ráfagas de un sonicador de sonda (Qsonica Q125), sonda de 2 mm de diámetro (QSonica. 4423), pulsos de 1 s con una amplitud establecida en 30 %. Las muestras en tampón RIPA se centrifugaron durante 10 min a 10 000 × g a 4 °C y se recogió el sobrenadante, aunque había poco o ningún sedimento. Se utilizó un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Fisher, 23223, ácido bicinconínico; Fisher, 23224, sulfato de cobre) para estimar la cantidad de proteína en las fracciones de tampón de lisis débil y fuerte (RIPA) antes del almacenamiento a -80 °C.

Se preparó un tampón de muestra 3X (140 µl de glicerol al 50 %/azul de bromofenol 0,1, 40 µl de SDS al 10 % y 20 µl de beta-mercaptoetanol) y se añadió a 5–10 µg de proteína de cada muestra. Las muestras se incubaron a 100 °C durante 5 min, se enfriaron en hielo, se mezclaron brevemente y se centrifugaron, y se cargaron en un gel prefabricado de 26 pocillos Criterion TGX al 4–20 % (Bio-Rad, 5671095) en tampón de ejecución (base Trizma al 3,03 %, 14,4% glicina, 1% SDS). Se utilizó una escalera Precision Plus Protein Dual Xtra (Bio-Rad, 161-0377) porque el rango de marcadores de proteína recombinante (2–250 kD) incluía marcadores de alrededor de 14 kD, donde se prevé que esté presente α-syn. Los geles se corrieron a voltaje constante, comenzando a 90 V durante 45 min, luego a 130 V hasta que el frente del colorante casi se escurrió del gel. Antes de que el gel terminara de correr, se prepararon las membranas para la transferencia. Para las transferencias α-syn, se sumergieron una membrana de nitrocelulosa de 0,45 µm (Bio-Rad, 1620167) y un papel de transferencia (Bio-Rad, 1620118) durante al menos 5 min en tampón de transferencia (3,03 % de base Trizma, 14,4 % de glicina, 20 % de metanol). Para todas las demás proteínas, se activó una membrana Immobilon-FL (Millipore, IPFL00010) durante 30 s en metanol al 100 % y luego se sumergió en tampón de transferencia en lugar de la membrana de nitrocelulosa. Se realizó una transferencia húmeda a corriente constante, 400 mA, durante 45 min. Inmediatamente después de que se completó la transferencia, se retiraron las membranas y solo en el caso de las transferencias α-syn, se fijaron en paraformaldehído al 0,4 % en solución salina tamponada con tris (TBS) 1X (pH 7,4) durante 30 min. Las membranas se lavaron 2 × 5 min con TBS. Las membranas se incubaron en Revert Protein Dye (LI-COR 926-11021) durante 5 min, se lavaron 2 × 30 s con una solución de ácido acético glacial al 6,7 % y metanol al 30 %, se enjuagaron con ddH2O y se tomaron imágenes a 700 nm en un LI -COR Odyssey CLx para proteínas totales. Se retiraron las membranas, se lavaron 2 × 5 min con TBS y se bloquearon durante 1 h en TBS-Tween 1:1 (0,1 %): tampón de bloqueo StaringBlock T20 (Thermo Scientific, 37543). Las membranas se incubaron en anticuerpo primario en tampón de bloqueo TBS-Tween (0,1 %):StaringBlock T20 1:1 durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-α-syn de conejo 1:1000 (Abcam, ab212184, n.° de lote GR3185934), anti-α-syn de ratón 1:500 (Millipore, MABN1817, n.° de lote 3099686), anti-DAT de rata 1:500 (Millipore, MAB369, n.° de lote 3258730), anti-DAT de conejo 1:1000 (Sigma-Aldrich, D6944, n.° de lote 087M4786V), anti-β2AR de conejo 1:1000 (Invitrogen, MA5-32570, n.° de lote UH2832117), 1: 500 anti-β2AR de conejo fosforilados en serina 355 (Invitrogen, PA5-38403, n.° de lote UI2847382), y 1:500 anti-β2AR de conejo fosforilados en serina 346 (Invitrogen, PA5-36784, n.° de lote UH2832047). Las membranas se lavaron 3 × 5 min con TBS-Tween (0,1 %) y se incubaron en anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: IRDye 800CW anti-conejo de asno 1:15 000 (LI-COR, 926-32213, n.° de lote C60322-03), IRDye 800CW anti-ratón de cabra 1:15 000 (LI-COR, 926-32210, n.° de lote C20808-02), o 1:15,000 cabra anti-rata IRDye 800CW (LI-COR, 926-32219, Lote #C90813-13). Las membranas se mantuvieron en la oscuridad y se lavaron 3 × 5 min con TBS-Tween (0,1 %), 1 × 5 min en TBS y se tomaron imágenes en un LI-COR Odyssey CLx para la proteína de interés. La densitometría de banda se realizó utilizando LI-COR Image Studio Lite (Versión 5.2). Se dibujaron cajas alrededor de la tinción de proteína total y la banda objetivo correspondiente para obtener la señal de proteína total y la señal de la banda objetivo en cada carril. Las señales de cada carril de tinción de proteína total se dividieron por la señal de carril de tinción de proteína total más alta para calcular el factor de normalización de carril para cada carril. La señal normalizada para cada muestra se calculó dividiendo la señal de la banda objetivo por el factor de normalización de carril correspondiente. Los ejemplos de carriles de longitud completa representativos de transferencia Western (control de carga de proteína total y proteína objetivo) se encuentran en las Figs. 9 y 10.

Los ELISA se realizaron utilizando un kit ELISA tipo sándwich α-syn colorimétrico de ratón prefabricado (LS Bio, LS-F6284-1) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se diluyeron 1:20 para SN, 1:20 para cuerpo estriado y 1:25 para plasma en diluyente de muestra. Los estándares y las muestras se corrieron por duplicado. Se realizó un ensayo BCA usando las muestras diluidas restantes del SN y el cuerpo estriado, y se usó para normalizar los resultados a proteína. La absorbancia a 450 nm se leyó con un lector multimodo híbrido Synergy H1.

Secciones de tejido cerebral coronal de cuarenta micrómetros de espesor se lavaron en TBS con Triton X-100 (TBS-TX) y se incubaron en peróxido de hidrógeno del kit de pretratamiento RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 322330) durante 1 h. Las secciones se lavaron en TBS y luego se montaron en portaobjetos VistaVision HistoBond (VWR, Randor, PA; 16004-406) y se colocaron en un calentador de portaobjetos a 60 °C durante la noche. Luego, los portaobjetos se incubaron durante 10 minutos en tampón de recuperación de objetivos de ACD Biosciences a 99 °C y luego se lavaron dos veces en agua. El tejido se delineó con Pap Pen (Abcam, Cambridge, Reino Unido; ab2601), se incubó con proteasa ACD plus en un horno de hibridación a 40 °C durante 15 min, se lavó dos veces en agua y se incubó con la sonda para rata Adrb2 (Cat No: 468131, Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 457731) durante 2 h en el horno de hibridación a 40 °C, seguido de lavados en tampón de lavado ACD. Luego se realizaron seis pasos de amplificación con los tampones de amplificación (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 322300) alternando intervalos de incubación de 30 y 15 minutos en el horno de hibridación según las instrucciones del fabricante. El tejido se desarrolló utilizando el reactivo DAB suministrado, se lavó en TBS-TX, se sometió a lavados ascendentes con etanol y se aclaró con xilenos. Los portaobjetos se cubrieron con Cytoseal 60 y se tomaron imágenes con un microscopio Nikon Eclipse 90i con una cámara QICAM (QImaging, Surrey, Columbia Británica, Canadá).

Todos los disolventes eran de grado LC-MS y se adquirieron de Fisher Scientific. Todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los filtros giratorios se adquirieron de Millipore Sigma. Se utilizaron 100 μL de plasma de rata y 50 μL de plasma de ratón por muestra. El plasma se precipitó con acetona helada 4:1 a -20 °C durante la noche. Después de la centrifugación (18 000 × g, 2 min), se eliminó el sobrenadante y se secó completamente (30 °C usando una centrífuga de vacío). Las muestras se resuspendieron en 300 µl de ácido fórmico al 0,1 %. Las partículas insolubles se eliminaron por filtración con un filtro giratorio de corte de 3 kDa. El flujo continuo se secó hasta completarse y se resuspendió en 20 μl de ácido fórmico al 0,1 %, ACN al 2 %, con 2,5 ng/ml de clembuterol-d9 pesado. Las curvas de calibración se generaron mezclando plasma no tratado de 5 animales (rata o ratón) y agregando clenbuterol al plasma mixto en concentraciones de 0,06, 0,2, 0,6, 2,0, 6,0, 20,0, 60,0 y 200,0 ng/mL. Todos los experimentos se realizaron en un espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Q Exactive™ HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ con un sistema Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 UHPLC. Cada análisis consta de tres gradientes de fase inversa de 15 min con inyecciones de muestra de 2 µl. Las separaciones utilizan una columna EasySpray C18 de 15 cm. Las muestras se cargan en un cartucho trampa C18 de 5 mm para la desalinización en línea antes de la separación cromatográfica. Las muestras se adquirieron por triplicado.

El análisis de espectrometría de masas utilizó el modo de exploración PRM para aislar y fragmentar clenbuterol (277,08690 m/z) y clenbuterol pesado (286,14339 m/z). Los espectros de masas de fragmentos se adquirieron a una resolución de 15.000 (200 m/z), con un AGC de 2e5 y un tiempo de inyección máximo de 100 ms. Los péptidos se fragmentaron con colisión escalonada NCE 25, 50 y una ventana de aislamiento de 1,3 m/z. El voltaje de electropulverización fue de 1,9 kV. Los cálculos de área y selección máxima se realizaron con la versión 4.2 de Skyline. Todos los picos se validan manualmente. Las áreas máximas sumadas de fragmentos de clenbuterol 203,01373 m/z, 168,044877 m/z y 132,068199 m/z, normalizadas a las áreas máximas sumadas de fragmentos pesados ​​de clenbuterol 204,020006 m/z, 169,051154 m/z y 133,074476 m/z son usados para la cuantificación.

Todos los disolventes eran de grado LC-MS y se adquirieron de Fisher Scientific. Todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los filtros giratorios se adquirieron de Millipore Sigma. Se secuestraron golpes de 5 a 10 mg de tejido cerebral en fracciones "ligadas" y "no ligadas". Las fracciones "unidas" representan clembuterol unido a proteínas, como la interacción con β2AR. La preparación de las fracciones "Total", "Sin consolidar" y "Unidas" para cada muestra es como sigue. Todas las manipulaciones se realizaron en hielo. Las muestras se lisaron mediante sonicación durante 10 s en 200 μl de bicarbonato de amonio 25 mM (AMBIC), pH 8. Se eliminaron 10 μl de sobrenadante como representación del clembuterol "total" y se reservaron. Las muestras se centrifugaron (18 K × G, 10 min). El sobrenadante restante se filtró por centrifugación (3 kDa 18 K × G, 10 min) sin enjuagar. El flujo continuo se recogió como fracciones "no unidas". El material retenido en el filtro se recogió mediante giro invertido (18 K × G, 2 min) como fracciones "Unidas". El material de cerebro sedimentado se extrajo con 200 μL de ACN al 60 %, MeOH al 30 %, AMBIC 25 mM al 10 %, pH 8, se sonicó durante 10 s y se centrifugó (18 K × G, 10 min). Se eliminó el sobrenadante y se combinó con las fracciones "Unidas". Las proteínas de las fracciones "Total", "No unida" y "Unida" se precipitaron con acetona helada 5:1 a -20 °C durante la noche. Después de la centrifugación (18 K × G, 10 min), se eliminó el sobrenadante y se secó completamente (30 °C usando una centrífuga de vacío). Las fracciones "no unidas" se resuspendieron en 20 μl de FA al 0,1 %, ACN al 2 %, con 2,5 ng/ml de clembuterol-d9 pesado. Las fracciones "unidas" se resuspendieron en 20 μl de FA al 0,1 %, ACN al 2 %, con 2,5 ng/ml de clembuterol-d9 pesado. Se añadieron 180 μL de FA al 0,1 %, se filtró por rotación, se secó completamente y se resuspendió en 20 μL de FA al 0,1 %, ACN al 2 %.

Las fracciones "totales" se resuspendieron en 200 μl de ácido fórmico al 0,1 %, se filtraron por centrifugación, se secaron completamente y se resuspendieron en 20 μl de FA al 0,1 %, ACN al 2 %, con 2,5 ng/ml de clembuterol-d9 pesado. Las curvas de calibración "Sin unir" y "Unidas" se generaron combinando 10 mg de tejido cerebral no tratado de 10 ratones, sonicando en 2 ml de tampón, dividiendo el lisado en alícuotas en diez muestras y extrayendo 10 μl de cada alícuota. Las alícuotas se separaron en fracciones "Sin unir" y "Unidas" mediante filtración por rotación como se describe anteriormente. A continuación, cada fracción se enriqueció con clenbuterol en concentraciones de 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 pg, 1,0, 3,0 y 10,0 ng. Clenbuterol se extrajo como se describe anteriormente.

La curva de calibración "total" se generó combinando 10 mg de tejido cerebral no tratado de ocho ratones, sometiendo a ultrasonidos a 1,6 ml de tampón, dividiendo en alícuotas el lisado en 8 muestras y añadiendo clenbuterol a concentraciones de 3,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 pg, 1,0, 3,0 y 10,0 ng.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism versión 7.03 y la significación para todos los casos se realizó con α ≤ 0,05. Los valores atípicos se evaluaron utilizando la desviación absoluta del método de la mediana78, con una diferencia "muy conservadora" de 2,5X desviación absoluta mediana utilizada como criterio de exclusión. Los experimentos con dos grupos (es decir, control de solución salina y clenbuterol) se analizaron mediante una prueba t de dos colas. Los experimentos con múltiples grupos en un único punto de tiempo (es decir, control de solución salina, 10, 20 y 40 mg/kg de clembuterol) se analizaron con ANOVA unidireccional y pruebas de Tukey post-hoc para comparaciones múltiples. Los experimentos con múltiples grupos en el punto de tiempo de 1 día y 1 semana se analizaron con ANOVA de dos vías y pruebas de Tukey post-hoc para comparaciones múltiples. El análisis de los cambios de peso se realizó con un ANOVA de medidas repetidas de dos vías y la prueba post-hoc de Sidak (ratones) o la prueba de Tukey (rata) para comparaciones múltiples. Todas las medias de grupo, errores estándar e información de pruebas estadísticas para todos los resultados se pueden encontrar en el documento de estadísticas complementarias.

Se sembraron neuronas corticales primarias de rata Sprague-Dawley E18 con 50 células K por pocillo en una placa recubierta con poli-D-lisina de 96 pocillos. En DIV11, se añadieron vehículo DMSO o clembuterol (concentración de pocillo final de 1, 5, 10 o 20 µM). Dos días más tarde, en DIV 13, las células se lavaron con PBS, luego se añadieron a cada pocillo 175 µl de tampón RLT Plus con β-mercaptoetanol al 0,1 %. Después de combinar 2 pocillos por muestra, un kit Qiagen RNeasy Plus Mini emparejado con un QiaCube extraía el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la síntesis de ADNc, se agregaron 16 µL de ARN a 4 µL de 5x iScript RT Supermix (Bio-Rad) y se colocaron en un termociclador (5 min a 25 °C, 30 min a 42 °C, 1 min a 85 °C, mantener a 4 °C). Se utilizó Multiplex TaqMan RT-qPCR para cuantificar la expresión génica relativa en un volumen de reacción de 10 uL con un colorante de referencia ROX. Se usaron un Snca de rata personalizado (adelante: CTGTACCTGCCCCTCAGCAT; reverso: AGCCTGCTACCATGTATTCACTGTAG; sonda: CGGTGCTCCCCTCT) y Xpnpep1 comercial (Applied Biosystems Rn00590960_m1) cebadores/sonda. La amplificación de Snca se normalizó a la de Xpnpep1. Los valores de cambio de pliegue se calcularon usando el método ΔΔCt y se expresó la proporción de muestras tratadas con fármaco y control. Los datos se analizaron con la herramienta web en la nube Thermo Fisher Connect y Microsoft Excel. Se usó el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para evaluar la toxicidad de los tratamientos.

Los ratones C57BL/6 J (n = 24: diez de solución salina y 14 de clenbuterol) recibieron una única inyección ip de 10 mg/kg de clenbuterol o un volumen igual de control de solución salina. Los animales se sacrificaron 24 h después de la dosificación, se extrajo el cerebro y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los cerebros se seccionaron en un criostato y se recogieron muestras congeladas de la SN. Las muestras de tejido se homogeneizaron en QIAzol usando un Omni Bead Disruptor (45 s encendido, 30 s apagado, 45 s encendido). Después de 5 min a temperatura ambiente, se añadieron 200 uL de cloroformo y las muestras se agitaron durante 15 s. Después de 3 min a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 12 000 rpm durante 15 min a 4 °C. Se combinaron 400 uL de la capa acuosa resultante con un volumen igual de etanol al 70 % y se extrajo posteriormente el ARN usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa de 300 ng de ARN se realizó en un volumen de reacción de 20 uL usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO (Thermo Fisher). Este volumen de reacción se diluyó 1:2 con agua antes de cargar 2 uL en una reacción de qPCR de 10 uL que contenía 5 uL de mezcla maestra de expresión génica TaqMan (Thermo Fisher, 4369016) y 0,2 uM de ensayo TaqMan específico de genes. Se utilizaron cebadores/sonda TaqMan, idénticos a los utilizados en Mittal et al37, para Snca (Applied Biosystems Mm01188700_m1), que se normalizó a Rpl13a (Applied Biosystems Mm02342645_g1), Actb (Applied Biosystems Mm00607939_s1) o Ubc (Applied Biosystems Mm011981 58_m1) . Para todas las muestras, el gen de interés se normalizó al gen de referencia o la media geométrica de los tres genes de referencia. ActB y Ubc se seleccionaron en función de su expresión estable, su uso conocido como genes domésticos y su uso anterior en el informe original en el que se basa este estudio37. De manera similar, también se usó Rpl13a porque el gen relacionado Rpl13 se usó como uno de los genes de referencia en el informe anterior37. El uso de diferentes genes de referencia para la normalización no afectó a los resultados generales. Los resultados que utilizan genes de limpieza que no se muestran en el manuscrito principal se pueden encontrar en la Fig. 8 complementaria.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

La información de la prueba estadística para todos los resultados se puede encontrar en el documento de estadísticas complementarias. Los datos que respaldan los hallazgos de este artículo están disponibles previa solicitud razonable al autor de correspondencia.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Michael J. Fox para el Programa de avance de objetivos de investigación de Parkinson. Los autores también quisieran agradecer al Dr. Andrew Koemeter-Cox de la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson por su visión adicional del proyecto y por facilitar las discusiones entre los laboratorios.

Departamento de Neurociencia Traslacional, Universidad Estatal de Michigan, Grand Rapids, MI, EE. UU.

Joseph R. Patterson, Jacob W. Howe, Allyson Cole-Strauss, Christopher J. Kemp, Megan F. Duffy, Jared Lamp, Andrew Umstead, Michael Kubik, Anna C. Stoll, Irving E. Vega, Kathy Steece-Collier y Caryl E. Sortwell

Unidad de Investigación de Enfermedades Neurodegenerativas, Biogen, Cambridge, MA, EE. UU.

Warren D. Hirst, Yi Chen, Anne C. Campbell, Catherine L. Nezich y Kelly E. Glajch

Programa de Neurociencia, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, EE. UU.

Jacob W. Howe, Megan F. Duffy, Michael Kubik y Caryl E. Sortwell

Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidad Estatal de Grand Valley, Allendale, MI, EE. UU.

Christopher P Russell

Departamento de Farmacología y Toxicología, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, EE. UU.

Ana C. Stoll

Mercy Health Hauenstein Neuroscience Medical Center, Grand Rapids, MI, EE. UU.

Caryl E. Sortwell

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Conceptualización: JRP, WDH y CES. Investigación: JRP, JWH, CPR, ACS, CJK, MFD, JL, AU, MK, ACS, IEV, KSC, YC, ACC, CLN y KEG. Preparación de manuscritos (primer borrador): JRP y CES. Preparación de manuscritos (revisión y edición): JRP, WDH, CES, JWH, CJK, MFD, JL, AU, MK, ACS, IEV, KSC, YC, ACC, CLN y KEG.

Correspondencia a Joseph R. Patterson.

WDH, YC, ACC, CLN y KEG son empleados de Biogen Inc. Los autores declaran que no tienen otros intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Patterson, JR, Hirst, WD, Howe, JW y col. El clenbuterol, agonista de los receptores adrenérgicos beta2, produce disminuciones transitorias en el ARNm de alfa-sinucleína, pero no una reducción a largo plazo en la proteína. npj Enfermedad de Parkinson. 8, 61 (2022). https://doi.org/10.1038/s41531-022-00322-x

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Recibido: 24 diciembre 2021

Aceptado: 08 abril 2022

Publicado: 24 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41531-022-00322-x

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