Los linfocitos T reguladores CD4+CD25hiCD127low periféricos aumentan en pacientes con cáncer gastrointestinal

Mar 06, 2023

Magnolia Medical amplía la familia de productos Steripath® Micro Initial Specimen Diversion Device® (ISDD®) con la nueva autorización FDA 510(k)

Mar 08, 2023

El pinchazo de agujas está ocurriendo en pubs y clubes australianos

Mar 10, 2023

Agujas Beneficio máximo del mercado y potencial de crecimiento de jugadores clave 2030: Hindustan Syringes & Medical Devices Limited, International Medsurg Connection, Nipro Medical Corporation, Medline Industries, Inc., Vita Needle Company

Mar 12, 2023

CML Biotech instala la primera máquina de fabricación de tubos de extracción de sangre integrada del mundo

Mar 14, 2023

Continúa la escasez de tubos de extracción de sangre

Envíe su consulta

ENTREGAR

Mar 22, 2023

Los linfocitos T reguladores CD4+CD25hiCD127low periféricos aumentan en pacientes con cáncer gastrointestinal

BMC Gastroenterología

BMC Gastroenterology volumen 23, Número de artículo: 168 (2023) Citar este artículo

271 Accesos

Detalles de métricas

Las células T reguladoras (Tregs) juegan un papel importante en la regulación de la respuesta inmune y la tolerancia inmunológica en el cáncer. El cáncer gastrointestinal sigue siendo una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en el mundo. Este estudio tuvo como objetivo detectar Tregs en pacientes con cáncer gastrointestinal.

En este estudio, se inscribieron 45 pacientes con cáncer gástrico, 50 pacientes con cáncer colorrectal y 50 controles sanos. Se utilizó citometría de flujo para detectar células CD4+CD25hiCD127low Tregs, CD4+CD25hi y CD4+ en sangre periférica. La citoquina interleuquina-10 (IL-10) y el factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) en sangre periférica y en el sobrenadante de cultivos de Tregs se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

En comparación con controles sanos, los niveles de Tregs CD4+CD25hiCD127low y células CD4+CD25hi aumentaron significativamente en pacientes con cáncer gastrointestinal. Los pacientes con cáncer gastrointestinal también mostraron un aumento significativo de los niveles de IL-10 y TGF-β1 tanto en sangre periférica como en medio de cultivo CD4+CD25hiCD127low Tregs.

El presente estudio demostró en primer lugar que los pacientes gastrointestinales tienen un estado inmunitario comprometido en el que las Treg CD4+CD25hiCD127low, así como los niveles de IL-10 y TGF-β1 están elevados. Los datos ofrecieron nueva información para comprender las características inmunológicas de los pacientes gastrointestinales, así como nuevos conocimientos sobre enfoques para desarrollar nuevas inmunoterapias para pacientes con cáncer gastrointestinal.

Informes de revisión por pares

Los tumores carcinoides gastrointestinales (GI) se usan colectivamente para referirse a los cánceres del tracto digestivo e incluyen cánceres gástricos, de páncreas, colorrectales y anales, de los cuales el cáncer gástrico (GC) y el cáncer colorrectal (CRC) representan la gran mayoría. Los cánceres gastrointestinales son neoplasias malignas comunes y una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. Por ejemplo, el GC es el tercer cáncer más común en los hombres y el quinto en las mujeres, y sigue siendo una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer [1, 2] y el CCR es el segundo cáncer más común diagnosticado en las mujeres y el tercero en los hombres [ 3], que impone una carga sanitaria considerable a nivel mundial. En los últimos años, con el desarrollo de la investigación en inmunología tumoral, la incapacidad del sistema inmunitario para erradicar el tumor es una de las características fundamentales del cáncer [4,5,6]. Los tumores explotan múltiples mecanismos para suprimir la inmunidad del huésped y promover la evasión inmune. El escape inmunitario, así como los puntos de control inmunitarios, desempeñan un papel clave en la aparición, el desarrollo, la invasión y la metástasis de numerosos cánceres [4,5,6].

Muchos estudios han informado sobre las funciones de las células T reguladoras (Treg) para ayudar a los tumores a evadir la vigilancia inmunológica [7, 8]. Tregs, un subconjunto de linfocitos T, es de gran importancia en la regulación de la inmunidad tumoral y la autoinmunidad que promueve la progresión tumoral al suprimir la inmunidad antitumoral efectiva [7, 8]. Los Treg naturales representan alrededor del 5 % del subconjunto de células CD4+ en la sangre periférica y expresan constitutivamente altos niveles de CD25 de alta afinidad. Recientemente, las células Treg se han identificado como células T CD4+CD25hi con niveles bajos de CD127 que expresan un fenotipo de superficie celular CD4+CD25hi CD127low [9, 10]. Las Treg también pueden inducir un microambiente inmunosupresor que bloquea la inmunoterapia tumoral exitosa [11, 12]. Las Treg pueden ejercer sus efectos inmunosupresores al estimular la secreción del factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) y la interleucina-10 (IL-10) [13,14,15]. TGF-β1 es un potente supresor del sistema inmunitario, que también es fundamental para la supresión inmunitaria dentro del microambiente tumoral [13]. Estudios recientes revelaron que TGF-β1 promovió la progresión, la invasión y la metástasis en el cáncer GI y también puede estar asociado con el pronóstico [16, 17]. La IL-10 es reconocida por inhibir la activación y la función efectora de las células T, monocitos y macrófagos, por lo que es una citocina multifuncional con diversos efectos en la inmunidad y el cáncer [18].

Aunque la acumulación de estudios informó un aumento significativo en la subpoblación CD4+CD25hiCD127low en algunos tumores [9, 19], la información de Tregs en el cáncer GI es muy limitada. La detección de Tregs CD4+CD25hiCD127low periféricos y citoquinas relacionadas ayudaría a evaluar y comprender de manera integral la función de la inmunidad del paciente desde múltiples perspectivas, a fin de guiar la práctica clínica para realizar una preevaluación más global. Por lo tanto, en este estudio, nuestro objetivo era detectar los niveles de Tregs CD4+CD25hiCD127low, TGF-β1 e IL-10 para evaluar el estado de inmunosupresión en pacientes con cáncer GI, lo que proporcionaría información útil para el desarrollo de inmunoterapias efectivas contra el cáncer GI.

El cáncer gástrico (GC, N = 45) y el cáncer colorrectal (CRC, N = 50) fueron reclutados en el Departamento de Oncología, Hospital Afiliado de la Ciudad de Ciencia y Tecnología de Suzhou de la Universidad Médica de Nanjing desde julio de 2016 hasta julio de 2020. Los siguientes criterios tenían a cumplir para la inclusión: 1) Diagnóstico con fibra gastroscopia o colonoscopia; 2) Sin radioquimioterapia, terapia inmunomoduladora, glucocorticoides o terapia con medicamentos no esteroideos dentro de los dos meses; 3) Información clínica completa. Se excluirían los pacientes que cumplieran uno de los siguientes criterios: 1) Haber recibido radioquimioterapia, terapia inmunomoduladora, glucocorticoides o terapia con medicamentos no esteroideos dentro de los dos meses; 2) Pacientes con infección aguda, inflamación crónica a largo plazo u otras enfermedades del sistema inmunitario; 3) Sin diagnóstico patológico; 4) Información clínica incompleta. Simultáneamente, 50 personas sanas determinadas por examen físico fueron seleccionadas para el grupo de control de salud (HC, N = 50). El estadio patológico de GC y CRC se clasificó en estadios I, II, III y IV de acuerdo con la octava edición del sistema de estadificación UICC/AJCC TNM. El estadio TMN estaba compuesto por la profundidad de la invasión tumoral (T), la metástasis en los ganglios linfáticos regionales (N) y la metástasis a distancia (M). En este estudio, los pacientes se dividieron en un grupo de estadio temprano (I + II) y un grupo de estadio tardío (III + IV). Además, de acuerdo con la clasificación histopatológica del cáncer gastrointestinal de la Organización Mundial de la Salud (OMS), la diferenciación tumoral también se clasificó en tres grados: deficiente, moderado y alto. Las características clínicas de todos los participantes se detallaron en la Tabla 1. Se recolectaron de ocho a diez mililitros de sangre venosa periférica temprano en la mañana de participantes en ayunas con tubos de recolección de sangre al vacío anticoagulados con heparina y luego se mezclaron completamente con EDTA para la anticoagulación. Luego, las muestras se almacenaron a temperatura ambiente y se tiñeron dentro de las 6 h. Todos los sujetos de la investigación participaron voluntariamente en este proyecto y firmaron un formulario de consentimiento informado. Además, el estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Suzhou afiliado a la Universidad Médica de Nanjing.

Para preparar las muestras para la citometría de flujo, se recolectaron 100 μl de sangre entera anticoagulada con EDTA en un tubo de ensayo de flujo dedicado. Las células se tiñeron in vitro utilizando el método de exclusión con azul de tripano y el porcentaje de células vivas tenía que ser superior al 99%. A continuación, se añadieron cantidades adecuadas de anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia (anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC y anti-CD127-PE) y se mezclaron las muestras. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad. Luego, los glóbulos rojos se lisaron, se incubaron en la oscuridad durante 12 min y luego se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min. Los sobrenadantes se descartaron y el sedimento celular resultante se resuspendió posteriormente en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se centrifugaron nuevamente durante 5 min a 1500 rpm, luego de lo cual se descartó el sobrenadante. Finalmente, se agregaron 400 μl de PBS al sedimento celular final y las células se examinaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences, California, EE. UU.). Los tubos de control se tiñeron utilizando el mismo procedimiento que el utilizado para el grupo experimental. A continuación, se analizó la presencia de células CD4+, CD4+CD25hi y CD4+CD25hiCD127low utilizando el software de análisis FACSDiva (BD Biosciences, California, EE. UU.). Los anticuerpos monoclonales anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC y anti-CD127-PE y los controles negativos apropiados (IgG1-FITC, IgG1-APC e IgG1-PE de ratón) se obtuvieron de BD Biosciences-Pharmingen.

Se usó el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para determinar los niveles de IL-10 y TGF-β1 en suero de sangre periférica. Brevemente, las placas de 96 pocillos se lavaron tres veces con un lavador automático de placas. Después del secado, se añadieron a los pocillos soluciones de serie estándar y de tampón analítico, y se gotearon secuencialmente 60 μl de tampón analítico en los pocillos restantes. Los anticuerpos conjugados con enzima se colocaron por goteo en cada pocillo y luego las placas se incubaron durante 1,5 horas a 22 °C. Luego, los pocillos se lavaron 3 veces (cada vez dura 5 min) con PBS. Cada pocillo se cubrió con 80 μl de solución de peroxidasa de rábano picante (HRP)-estreptavidina. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1,5 h y se lavó 3 veces antes de secarla. Luego, 100 μl de agente cromogénico se gotearon en los pocillos y las placas se incubaron a 20 °C durante 15 min. La densidad óptica se midió a 450 nm con un lector de microplacas y se calcularon las concentraciones de IL-10 y TGF-β1.

Para IL-10 y TGF-β1 en medio de cultivo Tregs, se usó centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll para obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de 5 ml de sangre periférica. Se utilizaron anticuerpos fluorescentes anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC y anti-CD127-PE para marcar las células. Los Treg CD4+CD25hiCD127low de alta pureza se separaron mediante citometría de flujo. Las Treg se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10 % y se añadieron 1 × 10 [6] a cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con anticuerpo CD3. Se añadieron a cada pocillo anticuerpo monoclonal anti-CD28 (1 µg/ml) e IL-2 (500 µg/ml). Después de ser cultivados durante 3 y 5 días, los sobrenadantes se recolectaron para medir los niveles de IL-10 y TGF-β1 mediante ELISA.

Los datos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM). Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Los resultados con un valor de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

En este estudio, había 23 hombres y 22 mujeres entre 32 y 72 años (57,8 ± 6,9) con cáncer gástrico. Los 50 pacientes con cáncer colorrectal que seleccionamos incluyeron 28 hombres y 22 mujeres, que tenían entre 47 y 73 (57.6 ± 3.2) años (Tabla 1). Las personas del grupo de control sano fueron seleccionadas del centro de examen físico.

Para evaluar la inmunosupresión de pacientes gastrointestinales, se detectaron Tregs CD4+CD25hiCD127low en sangre periférica mediante citometría de flujo. Un diagrama de dispersión de citometría de flujo muestra los porcentajes de Treg periféricos CD4+, CD4+CD25hi y CD4+CD25hiCD127low en pacientes con GI o controles sanos (Fig. 1A-C). Como se muestra en la Fig. 2A-C y la Tabla 2, en comparación con los controles sanos (HC), la proporción de CD4+CD25hi y CD4+CD25hiCD127lowTregs periféricos aumentó notablemente en el grupo GC (CD4+CD25hi: GC vs. HC; 13,11 ± 0,58 frente a 6,01 ± 0,33, P = 0,0008; CD4+CD25hiCD127low: GC frente a HC; 2,81 ± 0,36 frente a 1,68 ± 0,14, P = 0,0007) y grupo de pacientes con CCR (CD4+CD25hi: CRC frente a HC; 12,09 ± 0,69 6,01 ± 0,33, P = 0,0009; CD4+CD25hiCD127low: CRC frente a HC; 2,56 ± 0,18 frente a 1,68 ± 0,14, P = 0,0007), mientras que los porcentajes de células CD4+ periféricas disminuyeron en el GC (GC frente a HC; 33,95 ± 1,27 frente a 38,72 ± 0,73, P = 0,0009) o pacientes con CCR (CRC frente a HC; 35,94 ± 1,01 frente a 38,72 ± 0,73, P = 0,0233) (Fig. 2A-C). En particular, se determinó adicionalmente la proporción del subconjunto expandido de células CD4+CD25hi, o CD4+CD25hi CD127low Tregs a células CD4+; Los pacientes con GC y CCR demostraron un aumento en la proporción en comparación con los donantes sanos (Fig. 2D-E).

Gráfico de dispersión de citometría de flujo de pacientes con cáncer gastrointestinal y controles sanos. Izquierda: R1, un diagrama de dispersión de linfocitos; medio: las células T CD4+ fueron controladas por R1; derecha: CD4+CD25hiCD127low Tregs se configuraron con CD4+. HC, control sano; GC, cáncer gástrico; CCR, cáncer colorrectal

Las Treg CD4+CD25hiCD127low estaban reguladas al alza en pacientes con cáncer gastrointestinal. A Porcentaje de células CD4+ entre pacientes y controles sanos. B Porcentaje de células CD4+CD25hi entre pacientes y controles sanos. C Porcentaje de células CD4+CD25hiCD127low entre pacientes y controles sanos. D Porcentaje de células CD4+CD25hi entre las células CD4+. E Porcentaje de células CD4+CD25hiCD127low entre las células CD4+. HC, control sano (N = 50); GC, cáncer gástrico (N = 45); CCR, cáncer colorrectal (N = 50). N, número de pacientes o controles sanos. Los datos se presentaron como medias ± SEM y se analizaron mediante la prueba t de Student. *, P < 0,05; **, p < 0,01; ***, P < 0,001

Debido a que las Treg pueden ejercer sus efectos inmunosupresores mediante la estimulación de la producción de TGF-β1 e IL-10, se determinaron las concentraciones de las dos citoquinas en sangre periférica para evaluar más a fondo la condición inmunosupresora de los pacientes. En comparación con los controles sanos, las concentraciones de IL-10 y TGF-β1 aumentaron significativamente en la sangre periférica de los GC (IL-10: GC vs. HC; 4,28 ± 0,09 vs. 2,09 ± 0,15, P = 0,0006; TGF- β1: GC frente a HC; 28,51 ± 0,34 frente a 15,02 ± 0,31, P = 0,0008) y pacientes con CCR (IL-10: CRC frente a HC; 4,01 ± 0,12 frente a 2,09 ± 0,15, P = 0,0008; TGF-β1: CCR vs HC, 26,07 ± 0,29 vs 15,02 ± 0,31, P = 0,0005) (Fig. 3A-B y Tabla 3).

Aumentos de IL-10 y TGF-β1 en pacientes con cáncer gastrointestinal. A y B Concentración de IL-10 y TGF-β1 en sangre periférica de pacientes y controles sanos. Concentraciones de C y D IL-10 y TGF-β1 en el sobrenadante de Tregs. HC, control sano (N = 50); GC, cáncer gástrico (N = 45); CCR, cáncer colorrectal (N = 50). N, número de pacientes o controles sanos. Los datos se presentaron como medias ± SEM y se analizaron mediante la prueba t de Student. ***, P < 0,001

Para determinar aún más la relación de las dos citocinas y CD4+CD25hiCD127low Tregs, también se detectaron mediante ELISA las concentraciones de IL-10 y TGF-β1 en CD4+CD25hiCD127low Tregs cultivadas. En comparación con el grupo sano, las concentraciones de IL-10 y TGF-β1 en Tregs CD4+CD25hiCD127low aumentaron significativamente en la sangre periférica de los pacientes con GC y CCR (Fig. 3C-D y Tabla 4).

Aunque han surgido esfuerzos de investigación concentrados centrados en el cáncer GI, los efectos de la cirugía tradicional, la quimioterapia y la radioterapia son limitados, y un gran número de pacientes con cáncer GI todavía desarrollan recurrencia local y metástasis a distancia después de recibir estos tratamientos. Debido a que la inmunoterapia actual para el cáncer GI sigue siendo inadecuada, existe una gran necesidad de obtener información útil para desarrollar nuevas dianas terapéuticas en el cáncer GI. En el estudio actual, encontramos que, en comparación con los controles sanos, las células Treg CD4+CD25hiCD127low, las células CD4+CD25hi y las citoquinas relacionadas, IL-10 y TGF-β1, aumentaron significativamente en pacientes con cáncer gastrointestinal.

La respuesta inmune en el desarrollo del cáncer, la recurrencia y especialmente el tratamiento es de gran importancia. Las Treg CD4+CD25hiCD127low participan en la autotolerancia inmunitaria y la regulación de la homeostasis inmunitaria durante la respuesta inmunitaria fisiopatológica [20]. La acumulación de estudios ha demostrado que una gran cantidad de Tregs CD4+CD25hiCD127low se infiltran en varios tipos de tumores en humanos, incluido el cáncer del tracto gastrointestinal [21,22,23,24]. Además, las Treg generalmente se consideran inmunomoduladores clave que mantienen la tolerancia inmunológica e inducen un microambiente inmunosupresor [20, 23]. Para evaluar el microambiente inmunosupresor de los pacientes con cáncer GI, usamos citometría de flujo para detectar células CD4+ periféricas y Tregs CD4+CD25hiCD127low, y los resultados demostraron que las Tregs CD4+CD25hiCD127low y las células CD4+CD25hi aumentaron significativamente en pacientes con cáncer GI en comparación con los sanos. grupo.

CD4+CD25hiCD127low Tregs puede regular sus efectos supresores mediante la estimulación de la producción de IL-10 y TGF-β1 [13,14,15]. La IL-10 está estrechamente relacionada con el desarrollo y el pronóstico del cáncer gastrointestinal [25,26,27]. La IL-10 modula claramente el comportamiento de las células cancerosas gastrointestinales, como resultado de distintos perfiles proteolíticos que afectan la invasión celular y la angiogénesis, y se ha demostrado que la expresión alta de IL-10 está significativamente asociada con un peor pronóstico en pacientes gastrointestinales [26, 27]. La secreción de TGF-β1 por macrófagos asociados a tumores promueve la proliferación, invasión y metástasis del cáncer GI [28, 29]. En combinación, las altas expresiones de IL-10 y TGF-β1 promueven el desarrollo de cáncer GI, metástasis tumorales y conducen a un peor pronóstico. Este estudio también midió las concentraciones de IL-10 y TGF-β1 en sangre periférica y en cultivos de Treg CD4+CD25hiCD127low en pacientes con cáncer GI, y encontró que las dos citocinas eran significativamente más altas en pacientes con cáncer GI que en controles sanos. Estos datos en conjunto sugirieron que el aumento de Tregs CD4+CD25hiCD127low, acompañado de niveles más altos de IL-10 y TGF-β1 en pacientes con cáncer GI, podría desempeñar un papel en el desarrollo y pronóstico del cáncer GI.

Además, nuestra investigación anterior demostró que las Tregs CD4+CD25hiCD127low en sangre periférica tenían un gran valor para la selección de opciones de tratamiento individualizadas apropiadas para pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas [19]. Además, la expresión de PD-L1 en la superficie de Tregs CD4+CD25hiCD127low periféricos aumentó significativamente en pacientes con carcinoma hepatocelular primario, especialmente en pacientes con enfermedad avanzada, lo que sugiere que la expresión alta de PD-L1 en la superficie de CD4+CD25hiCD127low Las Treg pueden estar relacionadas con la progresión tumoral y el pronóstico del paciente [24]. Por lo tanto, determinar la expresión de PD-L1 en la superficie de Tregs CD4+CD25hiCD127low en cáncer GI mejoraría nuestra comprensión de la relación entre Tregs CD4+CD25hiCD127low y el tratamiento o pronóstico de pacientes GI. Dichos estudios son actualmente el foco de una intensa investigación en curso en nuestro laboratorio.

En conclusión, los hallazgos actuales indicaron en primer lugar que los pacientes gastrointestinales tienen un estado inmunitario comprometido en el que se reducen las células CD4+ y se elevan las Treg CD4+CD25hiCD127low. Las Tregs CD4+CD25hiCD127low periféricas podrían usarse para la evaluación del estado inmunosupresor de pacientes con cáncer GI y podrían ayudar a evaluar la eficacia potencial de las inmunoterapias tumorales en el cáncer GI. Las terapias dirigidas a CD4+CD25hiCD127low Tregs, IL-10 y TGF-β1 en pacientes con cáncer GI serían de gran importancia clínica en la individualización y optimización del tratamiento en el futuro.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Células T reguladoras

Citocina interleucina-10

Transformando el factor de crecimiento-β1

Los tumores carcinoides gastrointestinales

Cáncer gástrico

Cáncer colonrectal

Alberts, SR, Cervantes, A. & van de Velde, CJ Cáncer gástrico: epidemiología, patología y tratamiento. Annals of oncology: revista oficial de la Sociedad Europea de Oncología Médica 14 Suppl 2, ii31–36, https://doi.org/10.1093/annonc/mdg726 (2003).

Hohenberger P, Gretschel S. Cáncer gástrico. Lancet (Londres, Inglaterra). 2003;362:305–15. https://doi.org/10.1016/s0140-6736(03)13975-x.

Artículo PubMed Google Académico

Bray, F. et al. Estadísticas mundiales de cáncer 2018: estimaciones de GLOBOCAN de incidencia y mortalidad en todo el mundo para 36 cánceres en 185 países. CA: una revista de cáncer para médicos 68, 394–424, https://doi.org/10.3322/caac.21492 (2018).

Dyck L, Molinos KHG. Puntos de control inmunológico y su inhibición en cáncer y enfermedades infecciosas. Eur J Inmunol. 2017;47:765–79. https://doi.org/10.1002/eji.201646875.